长效抑制基因表达：GeneEraser shRNA表达载体

    近年来的研究发现，一些小的双链RNA可以通过促使mRNA降解，高效、特异的阻断体内特定基因表达。称为RNA干扰（RNA interference，RNAi）。由于RNAi可以作为一种简单有效的代替基因敲除的工具，在功能基因组学研究、基因治疗等领域得到了越来越多的重视。为此被Science评为2001年最重要成果之一。RNAi，即引入双链RNA，通过特异性结合互补链从而抑制基因表达/引发转录后沉默。许多的研究人员开始用RNAi作为一种工具研究基因功能。较早的哺乳动物RNAi实验中，siRNAs通过化学方法合成。进一步的，开始有了商业化的体外转录方法合成siRNA的试剂盒提供，比化学合成方法经济。现在已有研究小组开发表达载体，能够在哺乳动物细胞中持续表达siRNAs。Stratagene的新产品GeneEraser™ shRNA expression vector，可以表达shRNA，在体内加工后形成类似siRNAs的分子，能够引发RNAi过程。

    小干扰RNA分子(siRNA)已迅速成为一个通过抑制目的基因的表达来研究哺乳动物基因产物功能的强大的工具。通常这些短的，双链RNA分子(shRNA)是由体外产生且价格昂贵。采用Pol III启动子在体内表达短发夹RNA(shRNA)是有效的降低基因表达一个更为经济的方法。Strtagene开发了GeneEraser shRNA表达系统优化了shRNA的表达及基因的抑制。体外合成siRNA的方法尽管非常有效，但其抑制的持久性通常仅有5-7天，使之不能用来进行长期的基因抑制。而用体内表达短发夹RNA的方法，使不能持久抑制基因表达的问题迎刃而解。

    产生dsRNA分子的另一个有效的方法是在体内表达一个短发夹RNA分子(shRNA)。这种shRNA包含两个由一个小环序列所分离的短反向重复序列，是由Pol III启动子控制的。其中一个反向重复序列与目的基因互补。ShRNA随后被加工成siRNA,降解目的基因mRNA、抑制表达。

    GeneEraser shRNA 表达系统包括pGE-1载体及合适的对照用来在实验室中建立起系统。我们选择人类的U6启动子以有效的表达 shRNA。该启动子控制下，该系统在多种细胞系中都显示出对荧光素酶(对照)的持久的抑制，其持久的表达水平降低达到80-95%。

    PGE-1载体采用常见的pCMV-Script 作为骨架，在E.coli中提供了卡那选择标记，在哺乳动物中为新霉素。哺乳动物的选择标记给你的实验带来很多便利，特别当转染效率相当低时。通过挑选包含pGE-1载体的细胞，包含和表达shRNA的细胞数量被富集，可以用来作长期抑制的分析。

    实验室里新建一个系统常常很困难，所以我们提供GeneEraser shRNA expression controls，帮助刚刚投身于siRNA领域的研究者。此试剂盒包括荧光素酶表达质粒(pCMV-luc)，这是一个shRNA载体，表达抑制荧光素酶基因的shRNA(pGE-1-shluc)。另外提供阴性对照，其表达的shRNA与人、小鼠和大鼠的基因组没有任何同源性。

    基因抑制的有效性很大程度取决于目的基因序列的选择。目的序列可以随机选择也可以通过在目的基因的不同区域上测试不同的序列以决定何种序列是最有效的。以下所述几条对于shRNA设计的成功极为重要。

• 选择跟有AA序列的29个碱基，正义链和反义链都采用这29个碱基(不包括AA重复)来设计寡核苷酸。

• 避免在起始密码子或无义区域附近选择目的序列。

• ShRNA序列的GC含量应为40%-50%左右。

• 将挑选的序列在公共数据库中进行比较以确保目的序列与其它基因没有同源性。

• 通常克隆在shRNA表达载体中的shRNA包括两个由一茎环序列分隔的反向重复序列，随后在连上5-6个T作为RNA聚合酶III的转录终止子。

• 两个互补的寡核苷酸需带有5'BamHI和3'XbaI接头。

• Stratagene发现29个寡核苷酸较之原先推荐的23个寡核苷酸可以更有效的抑制目的基因。

• 在BamHI位点下游紧连一个C使插入片段和启动子有一定空间间隔以确保转录的发生。

• ShRNA目的序列的第一个碱基必须是G以确保RNA聚合酶转录。如果选择的目的序列不以G开头，必须在紧连正义链的上游加一个G。

• ShRNA插入片段中的茎环应当靠近寡核苷酸的中央。不同大小和核苷酸序列的茎环都被成功的运用过。其中包含一个独特的限制性酶切位点的茎环利于检测带有shRNA插入片段的克隆。如上图所示的茎环序列就包含一个HindIII酶切位点。5'TTCG3'通常作为茎环序列。而在比较了众多不同长度和序列的茎环，5'TCAAGAG3'序列最为有效。

• 5-6个T必须放置在shRNA插入片段尾部以确保RNA聚合酶III终止转录。

• 在正义链和反义链序列上不能出现连续3个或以上的T。这可能导致shRNA转录的提前终止。
  

If the upper strand of the target sequence does not begin with a G nucleotide, a G must be included immediately upstream of the target sequence.
Figure 3 shRNA insert design.