分离防御素
2006-12-21 22:51:46 信息来源：小木虫论坛
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1． 试剂：30％的醋酸，3只spectra/por管，HNP－3多克隆抗体，液氮
2． 器械和设备：超声破碎仪，离心管，离心机，4度的冰箱，bicinchoninic酸蛋白测定系统，液氮仪，S－200HR柱，S－200HR柱，tricineSDS-PAGE,AU-PAGE及激光测定
取来在COPD病人50毫升脓痰液
超声破碎3次，1分每次（幅度？）
30％的醋酸定容至100毫升，置于4度的冰箱中浓缩过夜
离心，27000转，20分钟（去除杂质）
真空蒸汽泵浓缩至10毫升（时间？）
5%醋酸溶于3只spectra/por管中，置于4度的冰箱中过夜(用against而不用with？)
提取物离心540转，10分钟
上清夜用S－200HR柱进行凝胶过滤（2.5×100cm，滤前用5％的醋酸平衡）
收集10毫升滤液
兔子抗HNP－3多克隆抗体进行ELISA（鉴定是否存在defensins）
使用SDS-PAGE纯化（减少的情况） 12.5%酸环境的AU-PAGE
使用真空泵浓缩
用bicinchoninic酸蛋白测定系统对浓缩蛋白进行测量
液氮中嗜酸性粒细胞崩解
离心去除细胞碎片(转速？时间？)
postnuclear上清夜离心27000转，20分钟
加入5％的醋酸溶液形成颗粒提取物
用S-200HR柱（4.8×105cm）过滤（时间？）
含有HNP-3的部分使用RP-HPLC作进一步的纯化(柱C18，4.6*250mm)
沉淀使用tricineSDS-PAGE,AU-PAGE及激光测定
使用Limulus测定defensins中LPS成分（HNP－1，2，3大约100微克每毫升，呼吸道细胞100匹克每毫升
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