何振艳 徐文忠 杨学习 麻 密②
(中国科学院植物研究所光合作用与环境分子生理学院重点实验室 北京 100093)
摘要 介绍了一种提取蕨类植物蜈蚣草(Pteris vittata L.)总RNA的有效方法。由于蜈蚣草富含多酚和多糖，用普通的RNA提取方法很难获得高质量的RNA。本方法通过优化提取缓冲液的条件来抑制多酚氧化，并利用RNA与多酚、多糖在不同浓度的2-丁氧乙醇中溶解度不同的特性来去除多酚和多糖。
本方法简便、快速，所提取的RNA质量较高，可直接用于cDNA合成、cDNA文库的构建以及RACE等分子生物学操作。
关键词 蜈蚣草，蕨类植物，多酚，多糖，RNA提取
An Effective Method of Total RNA Isolation from a Fern Plant — Pteris vittata L.
HE Zhen-Yan XU Wen-Zhong YANG Xue-Xi MA Mi②
(Key Laboratory of Plant Photosynthesis and Molecular Environmental Physiology, Institute of Botany, the
Chinese Academy of Sciences, Beijing 100093)
Abstract Here we reported on an effective method for total RNA isolation from a fern plant,Pteris vittata L. This method inhibits the oxidation of polyphenols by optimizing the conditions of the extraction buffer. Most of the polysaccharides and polyphenols extracted with nucleic acids are removed by taking advantage of differences in solubility of these compounds in the solvent 2-butoxyethanol. The whole process can be completed with a convenient manipulation in less than 2 hours. Isolated RNA has high purity and yield, and can be used for molecular manipulation such as the cDNA synthesis, cDNA library construction and RACE.
Key words Pteris vittata L., Fern, Polysaccharides, Polyphenols, RNA isolation
2001 年，《Nature》报道了世界上发现的第一种砷超富集植物(hyperaccumulator)——蜈蚣草(Pteris vittata L.)(Ma et al., 2001)。蜈蚣草属蕨类植物门、凤尾蕨科、凤尾蕨属，广布于我国长江以南各地区。最近越来越多的研究显示, 蜈蚣草和其他一些蕨类植物所具有的特性对于土壤砷污染的治理和植物砷抗性机制的研究都具有十分重要的意义(陈同斌等, 2002; Raab et al., 2004)。然而到目前为止，国内外尚无蜈蚣草砷抗性分子机制研究的报道。其他蕨类植物有关分子生物学的研究资料也很少。RNA提取是进行分子生物学研究的必要前提。由于蜈蚣草富含多酚和多糖，普通的RNA提取方法(如盐酸胍法和TRIZOL法等)很难获得高质量的RNA。在对多种RNA 提取方法进行比较和改进的基础上(Manning, 1991；Schneider et al., 1991；Sharma et al., 2003；Zhang et
al., 2003)，我们摸索出一种提取蕨类植物蜈蚣草总RNA 的有效方法。用该方法提取的RNA可直接用于cDNA 合成、cDNA 文库构建以及RACE 等分子生物学操作。
1 材料与方法
1.1 实验材料和试剂
蜈蚣草(Pteris vittata L.)采自我国湖北矿区，移栽在温室培养。取幼嫩叶片作为RNA提取材料。
各种试剂均为RNA实验专用。TRIZOL购于Invitrogen公司；Clontech PCR-SelectTM cDNA Subtraction Kit 和 SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit 购于Clontech 公司。
1.2.1 改进的RNA提取法 将0.5 mL 提取缓冲液(100 mmol.L-1 Tris-HCl, pH 8.3；500mmol.L-1 EDTA，500mmol.L-1 NaCl； 2%SDS; 5 mmol.L-1 DTT, pH 8.3)加入到1.5 mL离心管中, 加入1.5%(V/V)β - 巯基乙醇。将
100 mg新鲜的蜈蚣草叶片用液氮冷冻研磨后,迅速转到温浴的缓冲液中，剧烈震荡离心管，使组织与提取液充分混匀；70 ℃温浴6 分钟, 迅速置于冰上。待冷却后，12 000 g离心10 分钟，小心取出上清液；向上清液中加入0.1 mL 5 mol.L-1 NaCl， 混匀后，加入1/2体积的水饱和酚和1/2体积的氯仿,在旋涡振荡器上剧烈振荡2 分钟， 12 000 g 离心10 分钟,小心取出上清液。向上清液中加入1/4体积的2-丁氧乙醇和1.5%(V/V)的β-巯基乙醇，混匀，冰浴10 分钟；12 000 g 离心10 分钟，小心取出上清液；向上清液中加入1 体积的2-丁氧乙醇和1.5%(V/V)β-巯基乙醇，充分混匀后静置10 分钟，12 000 g 离心10 分钟，倒掉上清液。用50% 的2- 丁氧乙醇洗涤沉淀2 次，加入适量的DEPC 处理水溶解RNA。
1.2.2 硫氰酸胍一步法提取总RNA 参考《分子克隆实验指南》的方法(Sambrook et al., 1992)。
1.2.3 TRIZOL法提取总RNA TRIZOL总RNA 提取试剂盒购于Invitrogen 公司，严格按照试剂盒说明书操作。
1.3 RNA质量检测
用紫外分光光度计检测RNA 纯度和浓度, 用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测所提RNA的完整性。
1.4 cDNA文库构建
以1.2.1节中所述方法分别制备经砷诱导的处理和对照的RNA，并构建差异表达的SSH(suppressive subtraction hybridization)cDNA文库(按试剂盒提供的方法操作)。合成的cDNA 质量可以验证RNA 的质量。
2.3 改进方法提取的蜈蚣草RNA用于RACE方法克隆基因
用1.2.1 节中所述的RNA 提取法制备的RNA 进行RACE 对蜈蚣草ABCT r a n s p o r t e r 基因进行克隆。3 'RACE 和5'RACE以及全长基因的克隆(图3)都取得了成功。这证明RNA质量较高，可以满足RACE技术的要求。
3 讨论
3.1 防止酚类化合物被氧化的对策多次实验结果表明，硫氰酸胍提取液以及TRIZOL 试剂不适合于蜈蚣草RNA 的提取。因为这类强变性剂会使蕨类植物蜈蚣草细胞破碎后释放出大量的多酚和多糖。多酚类物质在酸性pH(pH4～6)条件下极易氧化使匀浆液变为褐色。被氧化的多酚化合物(如醌类)能与RNA 稳定地结合,导致RNA 活性丧失，在用苯酚、氯仿抽提时会导致RNA 的丢失，或形成不溶性复合物(Schneider et al.,1991)。
针对蜈蚣草RNA提取中的困难，本改进方法提高了研磨缓冲液的pH值(8.3)，同时加入了还原剂二硫苏糖醇(DTT)和β - 巯基乙醇，有效地防止了多酚类物质的氧化。在用硫氰酸胍和TRIZOL 等方法提取蜈蚣草的RNA 时，会出现极为严重的褐化现象，而应用本方法却很少发生此现象。
聚乙烯吡咯烷酮(PVP)中的CO-N=基有很强的结合多酚化合物的能力, 本研究也曾尝试使用这种多酚的螯合剂。在1.2.1 节中所述的RNA提取缓冲液中加入PVP，但无明显的作用。在硫氰酸胍提取液以及TRIZOL 试剂中加入PVP，一定程度上可以减轻褐化效应，但不能彻底去除这类化合物。硫氰酸胍提取液以及TRIZOL 试剂都是酸性溶液，而改进的提取缓冲液是碱性溶液，这说明用PVP去除多酚时pH值可能是一个重要的影响因素。也有研究表明在pH 8.0 以上时PVP结合多酚的能力会迅速降低(Loomis et al.,1966)。
3.2 多糖及多酚的去除
多糖的污染是提取蜈蚣草RNA时遇到的另一个棘手的问题。多糖的许多理化性质与RNA很相似,因此很难将它们分开。在去除多糖的同时RNA 也会被除去，造成RNA 产量的减少；在沉淀RNA时, 产生多糖的凝胶状沉淀, 这种含有多糖的RNA沉淀难溶于水, 或溶解后产生黏稠状的溶液。由于多糖可以抑制许多酶的活性, 因此污染了多糖的RNA样品无法用于进一步的分子生物学研究(李宏和王新力, 1999)。
LiCl 可以选择性地沉淀RNA, 获得的RNA较纯,并能去除大部分多糖,但实验周期较长, 沉淀RNA一般都需要至少2小时以上的冰浴。Manning(1991)曾报道多酚和多糖以及RNA在2- 丁氧乙醇中有不同溶解度的特性。而各种材料中所含有的多酚和多糖种类千差万别，具体的使用条件需要摸索。本方法利用高浓度钠盐可以沉淀多糖的特性并结合使用2- 丁氧乙醇来去除多酚和多糖。首先，在高浓度钠盐条件下，加入低浓度(1/4 体积)的
2-丁氧乙醇来沉淀多糖。在含有RNA的上清液中加入高浓度的2- 丁氧乙醇(50%)来沉淀RNA，同时多酚溶解于2- 丁氧乙醇中被除去。然后再用含50% 2- 丁氧乙醇洗涤RNA沉淀以去除残留的多酚。
随着更多的蕨类植物被发现在环境修复领域中具有重要用途，蕨类植物的分子生物学研究也会不断深入。本文所报道的这种简便有效的RNA提取方法，可以为今后蕨类植物的分子生物学研究提供借鉴。
