梁德勇　徐国恒　崔振中　王晓民　朱丽霞　韩济生

　　RNA是分子生物学研究的一个重要组成部分， 不论是cDNA文库的构建、RT-PCR、RNA序列分析、差异显示（mRNA differential display）、代表性差异分析 (representational Difference Analysis, RDA)、抑制性消减杂交（suppression Subtraction Hybridization, SSH）、Northern印迹分析、蛋白质的体外翻译等均依赖于高纯度完整的RNA。 因此, 如何获得高质量的RNA是研究人员关注的问题。1987年Chomczynski等^［1］建立了酸-异硫氰酸胍-苯酚-氯仿一步法（acid-guanidine-phenol-chloroform, AGPC）。该方法较以往的传统方法操作简单，无需特殊的设备，抽提时间缩短至4 h，因而得到广泛的应用。数家公司据此开发出RNA提取试剂盒^［2，3］。使用试剂盒简单方便，但价格相对昂贵。为探索操作简便、经济实用、快速有效的RNA提取方法，我们分析了大量相关文献资料，进行了多次实验，成功地研制出一种新型的RNA提取试剂，建立了其操作程序，我们称之为RNA快速提取一步法。其性能达到进口试剂盒的水平，但造价低廉、操作简便，特别适用于国内实验室。

1　材料与方法
1.1　试剂
　　变性液（4 mol^.L^－1异硫氰酸胍，25 mmol^.L^－1柠檬酸钠pH 7.0，5 g^.L^－1十二烷基肌氨酸钠,0.1 mol^.L^－1β－巯基乙醇），按文献［1］方法配制；2 mol^.L^－1的乙酸钠；重蒸酚；氯仿；异丙醇；8－羟基喹啉；柠檬酸；柠檬酸钠；乙酸；乙酸钠；800 ml^.L^－1乙醇；RNAzol试剂盒(Promega 公司)；Trireagent (Sigma 公司)。
1.2　仪器
　　电泳仪、岛津UV-160型紫外可见分光光度计（日本产）、超声匀浆仪（美国Sonics Material Inc. Jencons产品）、玻璃匀浆器。所用器皿均按RNA提取的一般要求进行处理^［4］。
1.3　标本
　　大鼠脑组织、脊髓组织、培养细胞。
1.4　RNA快速提取试剂的制备
1.4.1　酸酚的平衡　取重蒸酚于65℃水浴融化, 加入1 g^.L^－18-羟基喹啉；用50 mmol^.L^－1乙酸钠（pH 4.0）平衡。在平衡的过程中不断搅拌，并反复更换乙酸钠，待上清液相的pH值达到4.1为止。
1.4.2　CSB缓冲液的配制　用DEPC处理过的纯水配制CSB缓冲液，由42 mmol^.L^－1柠檬酸钠、8.3 g^.L^－1十二烷基肌氨酸钠和0.1 mol^.L^－1β-巯基乙醇组成。
1.4.3　快速RNA提取试剂的配制　用CSB缓冲液配制4 mol^.L^－1异硫氰酸胍；加入0.1体积4 mol^.L^－1乙酸钠（pH4.0）, 加入等体积酸酚，0.02体积的异戊醇，混匀，即为RNA快速提取试剂。4℃保存备用。
1.5　RNA快速提取程序
　　组织RNA的提取： 将约10～100 mg的组织块置于匀浆仪中，加入1 ml RNA快速提取试剂，进行匀浆；将匀浆液倾入1.5 ml离心管中，加入0.1体积的氯仿，振荡混合20 s；冰上放置5 min；4℃离心12　000 r^.min^－1, 15 min。离心管中的液体分为3层: 上层为无色透明的无机相，RNA保留于此相中；下层为呈淡黄色的有机相，蛋白质保留于此相中；上下两层的界面处为中间层，DNA保留于此相中。小心吸取上层水相约0.5 ml于新管中，切勿吸取中间层和下层液体，以避免DNA和蛋白质的污染。异丙醇沉淀：加入等体积的－20℃预冷的异丙醇，混匀，4℃离心12　000 r^.min^－1，15 min, 弃上清；用0.5 ml预冷的80％(体积分数)乙醇洗涤沉淀，弃尽乙醇，在空气中自然干燥，溶于适量DEPC处理的水中，用于后续的实验或－80℃保存。培养细胞RNA的提取： 培养细胞生长至旺盛期，弃掉培养基，用冰冷的PBS缓冲液冲洗两次，直接向细胞中加入1～2 ml RNA快速提取试剂，轻轻晃动培养瓶使细胞与RNA快速提取试剂充分接触，冰上放置5 min，吸出粘稠的细胞裂解混合物于新的离心管中，加入0.1体积的氯仿，振荡混匀。其余步骤与上述组织RNA提取方法相同。传统一步法提取RNA，按文献［1］方法进行；用Trireagent 或RNAzol提取RNA，按试剂盒说明操作。

2　结果
2.1　RNA的完整性
　　用快速一步法提取的RNA进行琼脂糖凝胶电泳，显示清晰的28 S，18 S和5 S三条带，表明RNA无降解、无明显的DNA污染，图1给出了一个代表性的实验结果，图2是用传统方法提取的电泳图，有较多的DNA污染。紫外分光光度法检查，图1脑组织RNA样品D₂₆₀/D₂₈₀的比值均在1.8～2.0之间，说明RNA未被蛋白质、酚污染，是高纯度的。用两种试剂盒提取的RNA与本法结果相似（图略）。用快速一步法提取的关节炎大鼠脊髓RNA作模板，进行DDRT-PCR，获得成功(图3)。

1，test;

图1　用快速一步法提取大鼠脑组织RNA的电泳图
Figure 1　Electrophoresis map of brain RNA by rapid one-step method

2,control.

图2　用传统方法提取大鼠脑组织RNA的电泳图
Figure 2　Electrophoresis map of brain RNA by acid-guanidine-phenol-chloroform (AGPC) method

图3　关节炎大鼠脊髓组织RNA样品的差异显示结果
Figure 3　Differential display map of spinal cord from arthritis rat

见表1

表1　4种RNA提取方法的比较

Table 1　Comparison of four RNA extraction methods

2.3　RNA快速提取试剂的稳定性
　　在实验中发现，按传统一步法配制的变性液稳定性不好，易出现浑浊，甚至析出结晶等不良现象。我们配制的RNA快速提取试剂4℃长期保存无浑浊、结晶析出等不良现象。用4℃保存3个月、6个月和12个月的试剂分别提取RNA，进行琼脂糖电泳鉴定无降解，表明该试剂具有很好的稳定性，可以长期保存使用，有效期至少是1年。
2.4　匀浆方式对RNA质量的影响
　　在实验中我们发现不同的匀浆方式对RNA的质量有明显的影响。通过反复实验发现，用超声匀浆仪匀浆易引起RNA的降解，且RNA的回收率很低；用手动玻璃匀浆器进行组织匀浆，获得的RNA无降解，回收率高，而且操作简单，是一种较理想的组织匀浆方式。

注：国家自然科学基金(39600192)资助项目。

作者单位：梁德勇　徐国恒　崔振中　王晓民　韩济生　北京医科大学神经科学研究所，北京　100083
朱丽霞　中国中医研究院针灸研究所

参考文献
1　Chomcznki P， Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidine thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal　Biochem， 1987, 162:156-159
2　Chevillard S. A method for sequential extraction of RAN and DNA from the sample, specially designed for a limited supply of biological material. Biotechniques， 1993, 1:22-24
3　Chomczynski P. A reagent for the Single-step Simultaneous isolation of RNA, DNA and proteins from cell and tissue samples. Biotechniques, 1993, 15:523-537
4　Sambrook P， Fritsch EF， Maniatis T. Molecular Cloning, A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.343-344
5　Han JH., Stratowa C, Rutter WJ. Isolation of full-length putative rat lysophosphipase cDNA using improved methods for mRNA isolation and cDNA cloning. Biochemisty, 1987， 26: 1617
6　Wallace DM.. Large- and small- scale Phenol extractions. Meth Enzymol， 1987, 152: 33～41