Northern blotting
2007-8-15 22:18:49 信息来源：来源网络
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1. 取RNA
2. 将电泳槽和板，梳齿浸泡在3%H2O2中20-30分钟，并吹干
3. 跑1%琼脂糖凝胶，检测样本RNA含量
4. 变性胶
在桌面上利用保险膜铺出一块干净的区域，将1.95g 琼脂糖加入110ml 的 DEPC-H2O （加热前可在三角瓶上做一个记号，在加热后把蒸发的水分补足）加热沸腾，冷却（补水）至60度左右。加入15ml 10xMOPS (PH8.0)和25ml 甲醛，混匀后倒胶，冷却待用。
5.电泳液（1L）
100ml 10xMOPS (PH7.0)
800ml DEPC-H2O
100ml 甲醛
6.sample buffer(-70度保存)
1650 μl 体系：
200μl 10xMOPS (PH8.0)
350μl 甲醛
1ml 甲酰胺
100μl loading buffer(DNA用染料)
用枪吹吸混匀
以样品RNA : sample buffer= 1:3 (v:v) 的比例加入 （RNA marker 同样）
点样前 68℃ 5分钟（RNA marker 同样）
7.跑电泳
120-150V，大约4-6小时（跑到整块胶还剩下1/3）每半个小时吸一次阳极的电泳液到阴极（平衡酸碱性），将胶切下。如加RNA marker 则用EB染5’，洗20’，将胶切去一个角作为位置记号。
8.转膜
转膜液： 20xSSC:
1000ml体系：
175.3g NaCl
88.2g 柠檬酸纳
NaOH 调节到PH7.0
定容
搭建盐桥：将20XSSC倒入白磁盘中，上担一块玻璃板，用一张大滤纸，两边浸入白盘中SSC，注意：防止短路，接触面不能有气泡，上反放胶，覆与胶等大的尼龙膜，再覆等大的滤纸，再压上一叠吸水纸，压上重物。
9.压膜16h以上，期间要换吸水纸。紫外交联2’。7XSSC洗15’。用滤纸包膜，以培养皿压住。
10.烘膜
80℃ 2h
旧膜以煮沸的洗膜液洗脱两次，10’每次轻柔震荡。
11.预杂交
先用水冲洗杂交管，再用洗膜液冲洗。
加5ML 预杂交液（杂交液没过膜即可）于杂交管中，将膜小心放入用杂交液将膜浸润，使其贴在管壁上，不可有气泡，有DNA的一面朝向管内，放入杂交炉中55度转3hr以上，（旧膜半小时）
12. 探针标记
1】做柱子
用烧红的针头将0.5ml的离心管底部戳一个小洞，加入玻璃纤维将开口堵住，入Sephadex G50 3000rpm 5’，待液体流尽后，加入TE洗涤三次（3000rpm 5’）。
2】标探针
在离心管中加入探针约2ul（20-70ng, 太多会竞争性吸收同位素），
oligo(kit1) 2μl
buffer(kit2) 2.5μl，
双蒸水12.5μl，
100℃ 5’，0℃ 5’
再加入dNTP(kit4) 2.5μl.
Klenow 1μl
双蒸水6ul
-p32-dCTP 1.5μl,
37℃水浴 20-30’
加入TE 100μl，过柱纯化，套上大1.5ML 安培管，3000 rpm 3-5min , 再加入100μl TE 洗柱子3000 rpm 3min, 加入4μl 6N NaOH 室温变性5min(可先将NaOH加入管中)
5.杂交
将探针加入杂交管中（注意不要加在膜上）65℃杂交过夜（大于16小时），膜不能干掉。
6.洗膜
室温下用少量洗膜液洗涤杂交膜3-5min，注意回收放射性洗液，倒入洗膜液，65℃ 10min 回收洗液，用放射性计数器测一下放射强度，视放射强度，然后重复1-2次。
7.压磷屏
用保鲜膜将膜包好（液体要吸干），压磷屏20hr左右，扫描观察。
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