Northern杂交试验指导手册（2）－RNA质量检测
2007-3-20 23:37:03 信息来源：来源网络
-
Northern杂交试验指导手册（2）－RNA质量检测
http://www.bioon.com 生 物 谷 网 站
二、RNA质量检测
提取的RNA需要对其质量和数量进行检测。实验室常用的方法有紫外吸收值检测和电泳检测两种。
方法一、紫外吸收检测
试剂：TE ( 10mmol/L Tris, 1mmol/LEDTA)。
dH2O
试验程序
1．预热紫外分光光度计10～20min.。
2．取两个1ml的狭缝石英杯，一个装入1mlTE溶液作为空白校正液，用来校正分光度计零点及调整透光度至100。
3．取4μl RNA待测样品加入另一比色杯中，加dH2O至1ml，用无菌石蜡膜堵住杯口，倒转混匀。
4．将两个比色杯置于分光光度计中，调入射光波长，用空白溶液分别调整T至100、OD至0，然后测定样品在260nm、280nm、230nm的OD值。
RNA浓度和纯度分析
浓度计算：对于单链RNA，OD260＝1.0时，RNA浓度为40μg/ml，按照上述稀释方式，即OD260＝0.1时，其RNA浓度为1μg/ml。
纯度分析：纯净的RNA样品其OD260/OD280的比值应介于1.7~2.0，小于此比值说明有蛋白或苯酚污染，如果比值大于2.0则可能被异硫氰酸胍污染；OD260/OD230比值应大于2.0，如果小于此比值说明有小分子及盐类污染。
方法二、变性琼脂糖凝胶电泳检测
试剂及其配制
MOPS缓冲液（10×）: 200mmol/L MOPS ( pH 7.0 )
50mmol/L NaAc
10mmol/L EDTA
准确称取41.86g MOPS, 6.8g NaAc, 3.72g EDTA，先用适量的用DEPC处理的水溶解NaAc，再将MOPS溶解其中，再加入已用同样方法处理水溶解的EDTA，混匀后用2mol/Ld NaOH将调整pH 至7.0，最后定溶至1000ml，过滤灭菌后避光保存。
上样染料：50%甘油，1mmol/L EDTA，0.4%溴酚蓝，0.4%二甲苯蓝
其它试剂：甲醛（37%溶液，13.3mol/L）
甲酰胺（去离子）
将10ml甲酰胺和1g离子交换树脂混合，室温搅拌1 小时后用Whatman滤纸过滤。等分成1ml于-70℃贮存。
溴化乙锭（EB，10mg/ml）
70%乙醇
试验程序
1．将制胶用具用70%乙醇冲洗一遍，晾干备用。
2．配制琼脂糖凝胶：称取0.5g琼脂糖，置于干净的烧瓶中，加入40ml蒸馏水，微波炉内加热溶化均匀。
3．待胶凉至60~70℃时，依次向其中加入9ml甲醛、5ml 10×MOPS缓冲液和0.5μl溴化乙锭，混合均匀后立即灌胶（注意避免产生气泡）。
4．样品制备：取DEPC处理过的500μl小离心管，依次加入10×MOPS缓冲液2μl、甲醛3.5μl、甲酰胺（去离子）10μl、RNA样品4.5μl，混合均匀；将离心管置于60℃水浴中保温10min.，再置于冰上2min.；向每管中加入3μl上样染料，混匀。
5．上样：将制备好的凝胶放入电泳槽中（上样孔一侧靠近阴极），加入电泳缓冲液（1×MOPS缓冲液），液面高出胶面1～2mm，小心拔出梳子使样品孔保持完好。用微量移液器将制备好的样品加入加样孔，每孔上样20～40μl。
6．电泳：盖上电泳槽，接通电源，样品端接负极，于7.5V/ml的电压下电泳2小时左右，当溴酚蓝到达凝胶底部时停止电泳。电泳结束后，即可在紫外灯下检测结果。
RNA样品质量分析：
完整的总RNA样品应呈现出三条条带，分别为28S rRNA、18S rRNA、5S rRNA。其中28S rRNA条带的亮度应约为18S rRNA条带亮度的2倍，这表明RNA样品比较完整，基本无降解。如果两条带的亮度反过来，则说明RNA样品已发生降解。如果在点样槽内或槽附近有荧光区带，则表明RNA样品中有DNA污染。
植物总RNA中28S rRNA及18S rRNA在变性胶上的迁移率相当于分子量5.1kb及2.0kb RNA的迁移率，以此可作为分子量的参考。
生物谷网站 http://www.bioon.com
实验频道录入：ztwpierre 责任编辑：ztwpierre
