2.2.2.1 选择亲和标签时需要考虑的因素

1.       亲和标签是否会影响到目标蛋白的结构和功能

亲和标签与目标蛋白之间的作用是相互的，需要综合的考虑，既要考虑到对目标蛋白结构功能的影响，又要考虑到对标签与其配体亲和作用的影响，以及实际的用途。大多数情况首选短的多肽标签，这是因为短的肽标签对目标蛋白的结构影响最小，在某些应用中，短肽不必要去除，因为重组蛋白已经具有完全的生物学功能，这也是6 个组氨酸标签比GST标签应用更广的原因，而且短肽不具有免疫原性，融合蛋白可直接的用于抗体的制备；而大的亲和标签可能限制重组蛋白的折叠，影响蛋白质的生物学功能。从另一方面来讲目标蛋白可能会干扰短肽标签与其配体的结合，与小的短肽标签相比，大的多肽和蛋白质标签也在实验室作为常规选择，它们的亲和配体大多是低分子化合物，可以降低目标蛋白对结合的影响，增强纯化的特异性（111），许多情况下，重组融合蛋白去除亲和标签后，目标蛋白可形成正确的结构。

2.       蛋白质的稳定性

含有多对二硫键的蛋白质或某些蛋白在进行非融合表达时，常容易形成包涵体，或有降解发生。降解的原因有两种情况，一是目标蛋白的不正确折叠，那么加入亲和标签如果能够促进目标蛋白的正确折叠将有助于防止蛋白质的降解，第二种情况是末端氨基酸不稳定，这时的原则是，N端融合有助于保护目标蛋白的N端，而C 端融合有助于保护目标蛋白的C 端，从而可以获得全长的目标蛋白。亲和标签对蛋白质包涵体的形成可以促进，也可以减少，不同的标签有不同的特性，多数情况还与表达系统相关。如麦芽糖结合蛋白（MBP）具有分子伴侣样的特性，进行N端融合，常有助于蛋白质的正确折叠和活性蛋白的获得，目的蛋白的MBP融合已成功用于晶体结构的研究（95）。

3.       亲和标签所融合的位置

亲和标签可以加在N端，可以加在C端，也进行串联，如图5 所示，在选择融合位置的时候，要考虑所处位置对标签亲和性的影响，如GST适合加在N端，还要考虑融合可能对目标蛋白的影响，如果目标蛋白的Ｃ端序列包埋在蛋白的内部，那么进行Ｃ端融合就不合适。多数情况下蛋白质的N端区域对蛋白质的功能不是太重要，所以在N端进行融合标签的融合常常能保留蛋白质的生物学功能。由于N端DNA序列对蛋白质的转录翻译影响较大，所以标签加在N端对蛋白质的表达水平影响更大，优化标签的mRNA结构可使表达水平提高。N端标签对表达蛋白的溶解性影响更大，如在N端使用天然HAT标签比6×His标签有助于目标蛋白的可溶性表达，而N端进行MBP融合表达也常用来提高目标蛋白的溶解性。进行分泌表达时，常选用可分泌的亲和标签，有些亲和标签不适合于放在N端，如6×His标签放在N端会影响重组蛋白信号肽的处理和目标蛋白的分泌，这是因为6×His标签具有多个带电咪唑残基。在选择融合位置时，另一个方面的考虑是，C端融合在去除融合标签后在目标蛋白的C端会有几个氨基酸残留，而小心的选择剪切特异性的氨基酸序列就可以在去除N端亲和标签后得到天然的目标蛋白。

图 5  进行载体构建时亲和标签相对目标蛋白所处的位置。

4.       是否需要在变性条件下进行亲和纯化

如果融合蛋白以包涵体的形式存在，由于大多数的亲和标签不适于在变性剂存在条件下进行亲和纯化，只能先进行包涵体的溶解和复性，再在非变性条件下进行亲和纯化，其中有些亲和标签可以促进蛋白的折叠复性，如来源于蛋白A的ZZ标签，可使胰岛素样生长因子Ⅰ（IGF-Ⅰ）融合蛋白在比非融合蛋白高100倍的浓度下成功折叠复性，并且不会形成沉淀（98），在选择亲和表达纯化系统时需要考虑。组氨酸标签在非变性和变性条件下通常均可进行亲和纯化，除了前面的这种方法可以使用，大多数情况下直接在变性条件下进行亲和纯化或亲和层析复性，而且亲和层析复性常常可以提高折叠的效率。

5.       亲和标签对表达水平的影响

亲和标签对表达水平的影响不仅与亲和标签和目标蛋白相关，还与可用的表达纯化系统密切相关，需根据具体情况进行分析。

6.        是否需要标签具有鉴定功能

首先要看针对目标蛋白是否有方便有效的分析鉴定方法，如果没有可选择能够进行重组蛋白检测的亲和标签。

7.       亲和洗脱的条件

表4 列出了亲和洗脱的条件，有些条件比较温和，而有些条件较为剧烈，选择的亲和表达系统应该不使目标蛋白变性。

8.       亲和介质和缓冲液的费用

9.       是否在亲和纯化后去除标签

融合蛋白是否需要去除标签，由目标蛋白的用途和标签的特点来确定，如果用于免疫动物生产抗体，则不需要，如果不影响蛋白的功能研究，也不需要，如果影响了蛋白的功能研究或用于临床治疗，则需要去除标签。

表 4 常用的亲和融合表达/纯化系统