2.2.1 层析技术在分离纯化中的应用

层析技术应用于蛋白质的分离纯化开始于60年代，现在已成为蛋白质分离纯化的高分辨的方法。在层析技术的发展过程中，首先是基质填料的发展。由于蛋白质大分子具有高的亲水性，要求分离介质具有亲水的界面，为活性大分子提供适宜的微环境，早期的离子交换介质不具有亲水的特性和大的孔结构，仅用于小分子的分离纯化，Peterson 和 Sober 等在离子交换介质的研究上进行了开拓性的工作，选择特定的纤维素作为离子交换基团的基质，合成的离子交换纤维素介质具有高的结合容量和低的不可逆性吸附，并得到实际应用（89,90）。在过去的几十年里各种层析用基质得到发展，如Sephacryl、Sepharose FF、 Sepharose HP、Superose、Superdex、SOURCE、Mono Beads、Toyopearl，这些基质都有其的物理和化学特点，在蛋白质的分离纯化中发挥着重要的作用。层析技术的另一个发展方向是功能基团的发展，适应不同的选择性要求，如各种不同亲和层析介质的合成，使一步纯化就能达到很高的纯度。层析技术的第三个发展方向是操作模式的多样化，已发展的操作模式有扩张床吸附、模拟移动床层析、置换层析、灌流层析和径向层析，这几种方法能够具有处理大体积样品的能力，适合于大规模生产应用。

在重组蛋白的分离纯化中，各种分离模式都得到应用。凝胶过滤层析是基于液相的分离方法，凝胶包裹的内环境形成固定相，凝胶的外环境形成流动相，蛋白质分子越大越不容易渗透进入固定相，所以又称为分子筛层析，层析的分辨率与介质的排阻极限和上样的体积有关，是一种易于操作的层析方法，另外凝胶过滤层析常用于缓冲液交换，此时可使用较大的载量。离子交换层析基于蛋白质与离子交换介质电荷间的相互作用，高于蛋白质等电点，蛋白质带负电荷，低于蛋白质等电点蛋白质带正电荷，不同的蛋白质在一定的pH条件下与介质上的离子之间相互作用不同，而产生不同的选择性，根据带电基团的类型和强度可分为四种类型：强阴离子交换层析、弱阴离子交换层析、强阳离子交换层析、弱阳离子交换层析，通常采用一定的平衡条件使目标蛋白选择性的吸附在介质上，也可以使杂蛋白吸附，而目标蛋白选择性的穿过。疏水层析基于蛋白质表面的疏水区和介质疏水配体间的相互作用，在高盐浓度条件下，蛋白质的疏水区表面上有序排列的水分子通过盐离子的破坏作用释放，裸露的疏水区与疏水配体相互作用而被吸附，随着盐浓度的降低，疏水性相互作用也降低，蛋白质的水化层又形成，蛋白质最终解吸附，其它物质，如乙二醇、甘油、非离子表面活性剂也可以降低疏水相互作用，而且疏水相互作用也受pH、温度和添加剂的影响。疏水层析的选择性依赖于疏水配体的结构，有烷基配体和芳香基配体，烷基的链越长，蛋白质的保留就越强。羟基磷灰石层析常用于抗体的分离纯化，对其分离的机制还了解的不清楚，但涉及介质上钙离子和磷酸根与蛋白上带电残基的相互作用。传统的片状羟基磷灰石物理和化学稳定性比较差，仅能在低流速条件下使用，新的球形羟基磷灰石克服了以上缺点，对于其它方法不易分离的蛋白质，可以用羟基磷灰石层析进行分离纯化。等点聚焦层析是基于蛋白质等电点不同的分离模式，以阴离子交换剂为固定相的情况为例，两性电解质缓冲液和离子交换基团相互作用形成pH梯度，蛋白质在pH 大于其等电点时吸附，在pH低于其等电点时解吸附，由于蛋白质区带后部所处微环境的pH总是低于蛋白质区带前部所处微环境的pH，处于后部区带的蛋白质先于前部开始移动，从而产生聚焦效应，因此可分离等电点仅差0.02的蛋白质。亲和层析基于蛋白质和亲和配体的特异性相互作用，是最为高效的分离纯化方法，用于亲和层析的配体可以是针对抗原的抗体、针对蛋白质分子的受体、酶的底物或抑制剂、针对糖分子的凝集素、活性染料、金属离子、天然或改造过的相互作用多肽等等。利用DNA重组技术，进行目标蛋白的融合表达，再用亲和层析进行分离纯化，已经成为蛋白质表达纯化的常用手段。

表 3 常用层析方法的分离特点和不同纯化阶段的适用性

蛋白质能否获得高效分离纯化既与层析介质的理化性质（如配基组成、配基密度、孔径、表面积、颗粒大小、颗粒分散性）有关，又与流动相参数（如有机溶剂、pH、金属离子、解离剂、氧化/还原剂、温度、缓冲液组成、离子强度、上样浓度和体积）有关，正是这些理化参数的变化使得层析技术具有更强的通用性，成为最重要的蛋白质分离纯化技术，表3 列出常用层析方法的分离特点和在不同纯化阶段的应用情况（94）。

2.2.2 亲和标签的在重组蛋白分离纯化中的应用

在重组蛋白的分离纯化中，与其它层析方法相比，亲和层析的纯化能力更为强大，一步纯化就可以得到很高的纯度，可以使蛋白质纯化100-1000倍，活性蛋白的回收率通常很高，而且可以纯化其它方法难以分离的蛋白质。从分离的机理上来讲，亲和层析是一种典型的吸附层析，分子与其介质上的配体结合具有特异性和可逆性，特异性使纯化具有选择性，而可逆性使蛋白质在适宜的条件下洗脱下来。基于重组蛋白质与配体的结合特性，一些重组蛋白质应用亲和层析进行纯化，如将抗体、受体或体外噬菌体展示技术筛选的亲和体（affibody）偶联在亲和介质上进行亲和纯化，但这类应用仅限于特定的蛋白质，而利用DNA重组技术使目标蛋白与亲和标签融合表达，控制重组分子的亲和选择性，进行融合蛋白的亲和纯化，已成为纯化重组蛋白的常用遗传策略。除了方便分离纯化，亲和标签的融合表达还有以下的优点：

1.       有的亲和标签可以提高目标蛋白可溶性表达的水平。但要注意的是可溶性表达并不能保证正确的折叠，融合蛋白可以形成可溶性的聚集体（106）。

2.       加入的标签提供检测目标蛋白的高灵敏度方法，如表位标签可以使用ELISA和Western blotting 进行定性和定量检测。

3.       亲和融合策略已广泛用于蛋白质-蛋白质相互作用研究和蛋白质复合物研究（99）。

4.       改善蛋白的药代和药动学特性，如一些细胞因子和免疫球蛋白G（IgG）的Fc段融合，可以性显著增加半衰期，与白蛋白结合结构域结合也可以起到相同的效果。