1.       概述

分离纯化组成了基因工程的下游处理（downstream processing）阶段，这一过程又和上游过程紧密相联系，上游过程的诸方面影响到下游的分离纯化，所以在进行目标蛋白质表达纯化时要统一考虑和整体设计，并充分考虑上游因素对下游的影响，如是否带有亲和标签，是否进行分泌表达。目前应用最广泛的表达系统有三大类，分别是大肠杆菌表达系统、酵母表达系统和CHO细胞表达系统，不同的表达系统和培养方法显著影响下游的处理过程，目标蛋白表达是否形成包涵体，目标蛋白表达的定位（胞内、细胞内膜、周质空间和胞外），蛋白表达的量都依赖于所选择的表达系统。选择将所表达的蛋白分泌到细胞外或周质空间可以避免破碎细胞的步骤，并且由于蛋白质种类少，目标蛋白容易纯化；而在细胞质内表达蛋白，可能是可溶性表达，可能形成包涵体，可溶性的蛋白往往需要复杂的纯化步骤，而包涵体易于分离，纯度较高，但回收具有生物活性的蛋白却变的相当困难，需要对聚集的蛋白进行变复性，通常活性蛋白的得率比较低，表1列出了不同策略对表达、纯化的影响，对于其中的有些缺点可以通过一定的方法进行克服和避免，如利用DNA重组技术给外源蛋白加上一个亲和纯化的标签，有助于可溶性外源蛋白的选择性纯化，并能保护目标蛋白不被降解（96）。

表 1 重组蛋白不同表达策略的优点和缺点

在细胞的提取物中，除了目标蛋白外，还含有其它各种性质的蛋白、核酸、多糖等。在这样一个混合体系中，蛋白质纯化要求将目标蛋白与其它的成分分离，得到一定的量，达到一定的纯度，同时要尽可能保留蛋白的生物活性，并使蛋白保持完整。所以蛋白质的分离纯化可以看作是一系列的分部收集过程，总是希望目标蛋白富集于其中的一个收集部位，而大量的杂蛋白存在于其它的收集部位。当然对目标蛋白纯度的要求要根据纯化蛋白的用途而定，对于治疗性的蛋白要求有大于99%的纯度，并对处方有活性和稳定性的要求，对于某些酶的纯度则要求较低，需要在纯度和得率之间进行一个平衡，所以下游的工艺流程取决于最终对目标蛋白的要求。

蛋白质的功能依赖于蛋白质的结构，对于有生物活性的蛋白质，在分离纯化过程中必须根据目标蛋白的特点，采用合适的操作条件和方法，保证目标蛋白的活性尽量不损失。除了在分离纯化的初期，要采用快速的方法除去影响目标蛋白稳定性的杂质，还要严格控制涉及蛋白质变性的各种因素，来避免蛋白质失去活性。蛋白质的构象稳定性可以通过测定蛋白质变性反应时折叠（f）和去折叠（u）间自由能的变化（ΔG_f→u）来衡量，ΔG_f→u越大蛋白质就越稳定。根据报导蛋白质的ΔG_f→u在5—20kcal/mol范围之间，单个氢键可造成0.5—2kcal/mol自由能的变化，一个离子对可造成0.4—1.0kcal/mol自由能的变化，因此ΔG_f→u相对比较小，这样天然状态仅仅比去折叠状态稳定一点，所以必须克服蛋白质内在的不稳定性，保留蛋白的活性。这一点在分离纯化和蛋白质储存中都很重要，影响蛋白质稳定性的因素有温度、pH、离子强度、某些添加剂、表面吸附、震摇、剪切力、冻融、蛋白浓度、压力等，这些因素对折叠的影响有的是可逆的，有的是不可逆的，而且相互之间也有影响，在实际处理中应选择合适的条件，尽量避免不利因素的影响（2），并利用活性跟踪的方法对处理进行评价，指导分离纯化。

在进行任何纯化工作时，第一步必须针对目标蛋白建立特异性的分析方法。这些特异性的分析方法都是基于目标蛋白的一些特性，如酶的活性，免疫学活性，物理特性（如分子量、等电点、光谱学特征等），生物学活性。在理想的情况下，我们希望所选择的分析方法具有特异、快速、灵敏和可定量的特点。特异性要求分析方法反映目标蛋白的独特性，以排除假阳性。快速则要求能很快的给出定性和定量结果，以便更好的与分离纯化的工作相衔接。灵敏的分析方法仅需要少量的样品，这就给操作带来了极大的方便。在分离纯化的每一步，都需要对蛋白和活性进行定量，这就要求分析方法有准确可定量的特点，以对分离纯化的效果进行评价。如通过SDS-PAGE电泳测定蛋白质分子量来鉴定蛋白质，由于电泳的分辨率限制，常常不能确定收集部位中是否含有目标蛋白或目标蛋白是否得到了富集，这时就需要运用更特异的分析方法，如Western blotting就可以从复杂的混合物中描述蛋白的分子量，并对蛋白进行定量。另外当一些蛋白没有方便可用的生物学活性测定方法，或者由于干扰物质的存在不能测活，可应用一些免疫学的方法进行检测。在纯化的过程中，需要监测以下几个参数：总的样品体积，样品中总的蛋白，目标蛋白的活性单位，通过这些基本的信息，就可以跟踪每步纯化的效率，计算出目标蛋白的回收率，目标蛋白的比活性，以及纯化的倍数，从而对纯化的每一步，乃至整个流程进行定量评价。Richard等在纯化重组大肠杆菌RNA聚合酶σ³²亚基的工作中给出了很好的范例，在定量测定项中，包括了蛋白质的定量测定、定量SDS-PAGE、定量蛋白质斑点印迹和酶活测定，使用这些方法对操作的每一个阶段取样进行纯化效果的评价，从而确保每一步纯化的有效性（1）。正是由于分析方法在分离纯化中的指导性作用，所以有效的分析方法是分离纯化是否能够成功的前提。