Pichia酵母表达直接PCR鉴定重组子的方法
2007-1-18 19:56:01 信息来源：丁香园论坛
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模板的处理：
1.平板上的菌落长到肉眼可见时（约12小时）；
2.将除了模板之外的其它PCR反应液的组分准备好，并分装。引物最好使用Kit中已有的检测专用的引物，或者一条使用载体上的引物，一条使用基因的特异性引物（这样做可以鉴定非定向克隆的方向）；
3.用半根灭菌的牙签（节约，而且好用）挑取菌落，在PCR管中涮以下，放入一个灭菌的1.5毫升离心管，对PCR管和1.5毫升离心管编号；
4.PCR扩增，1％ 琼脂糖凝胶电泳；
5.对于PCR扩增显现特异性条带的克隆，把置于1.5毫升离心管中的半截牙签扔到5毫升YPDZ培养基中，30度培养，8－12小时后提质粒，酶切鉴定确认。
PCR反应体系：
以TaKaRa Taq DNA聚合酶反应为例，引物为5´ AOX1 primer，3´AOX primer：
组分 20μl体系
10xReaction Buffer 2.0μl
dNTP 1.6μl
Primer 1（20pmol/L） 0.5μl
Primer 2（20pmol/L） 0.5μl
ddH2O 15.2μl
Taq DNA聚合酶 0.2μl
TOTAL 20.0μl
3.5.3 PCR反应条件：
初始变性 94℃ 4min 1
变性 94℃ 30s 30个循环
退火 50~54℃ 30s
延伸 72℃ 30s
结束延伸 72℃ 10min 1
保存 4℃ 1
如果筛选的是Mut+，将会出现两条带，一个是目的基因，另一个是2.2kb的AOX1基因，空质粒会出现以下条带（pPICZαA 588 bp)，将两者的大小加在一起来解释出现的实验结果。
我的结果是空载体的有大约580多的条带，但重组子的PCR只有将近1000bp的条带（我的目的基因是400bp），没有2.2kb的条带。
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