7. 立即将电转化池移至电极间放电,1~2min后,取出电转化池,水浴,立即进行下一步操作。
8. 用带有高压灭菌吸头的微量移液器将电穿孔的细胞转移至35 mm培养皿中。用等体积的培养基洗涤电转化池,洗液加入培养皿。培养皿置于含5%~7% CO2的37℃孵箱。
9. 重复第6~8步,电转化所有DNA与细胞样品。记录下每一电转化池的实际脉冲时间以便于比较。
10. 如要获得稳定转化体,直接进行第11步。如果是瞬时表达,则于电穿孔24~96 h后用下述方法之一检测细胞:
l 如果使用的是表达E.coli β-半乳糖苷酶的质粒DNA,检测细胞裂解液中酶活性。
l 如果使用绿色荧光蛋白表达载体,在450~490 nm光照下用显微镜检测细胞。
l 如果使用其它基因产物,则通过体内代谢标志物进行放射免疫、免疫印渍、免疫沉淀或测定细胞提取物的酶活性来分析新合成蛋白。
11.分离稳定转染体:用完全培养基培养48~72 h后,胰酶消化细胞,用适当的选择性培养基重铺细胞。每2~4天换液一次,持续2~3周,目的是去除死细胞残骸,并允许抗性细胞克隆生长。此后,克隆、繁殖独立克隆以用于检测[方法见Jakoby and Pastan 1979 或Spector et al. 1998b (《细胞试验手册》的第86章)]。


