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组织印迹的Northern杂交

组织印迹的Northern杂交

1)硝酸纤维素膜或尼龙膜上的组织印迹

1.在塑料板上放置两层Whatman 1号滤纸,在滤纸上方放上一张普通纸,然后铺上一层尼龙膜。

2.用双面刀片从植物组织如大豆的茎上切取一块切片(厚度约为1mm)。如果组织表面是湿的,则在Kimwipes纸上轻轻吸干或先用蒸馏水洗涤几秒钟然后再用Kimwipes纸吸干。用镊子将组织切片转移到硝酸纤维素膜上,注意一旦将切片放置在膜上就不得再移动切片。在切片上放置4Kimwipes纸,用手指轻压1520秒,用镊子小心拿开纸和组织切片。组织切片经甲苯酸蓝染色后观察其解剖结果。

3.80℃真空烘烤留有组织印迹的尼龙膜2小时或用UV cross-linker在紫外光下照射尼龙膜。

4.将留有印迹的膜面向下,放入载玻片上的一滴甲苯酸蓝溶液中,对组织切片进行染色。23分钟后,吸干多余的染料,用间接照明立刻照相。将载玻片翻转,透过玻璃拍摄被染色的组织切片。在切片上粘上几张纸片以免组织切片接触显微镜。

 

2)用35S-标记的RNA探针检测植物印迹中的mRNA

1.Seal-A-MealTM塑料带中倒入3040ml洗涤溶液I65℃清洗留有印迹的尼龙膜4小时。

2.将膜放入20ml杂交溶液中,68℃预杂交4小时。

3.将膜和用35S-标记的RNA放入10ml杂交溶液中,68℃杂交20小时。

4.100ml洗涤溶液Ⅱ中42℃清洗尼龙膜20分钟,换上新鲜洗涤溶液,重复清洗2次。

5.100ml洗涤溶液Ⅲ在适当的温度下(6068℃)。用手提式微型检测器监控尼龙膜上剩余的放射性。清洗完毕后,有义RNA探针杂交的膜不再有放射性信号,但用反义RNA探针杂交的尼龙膜一般具有可检测的放射性信号。该信号的强度依赖于目的RNA的丰度。室温下用0.2×SSC对尼龙膜进行简单清洗,在空气中晾干。

洗涤缓冲液Ⅲ:

0.1 mol/L Tris-HCl(pH8.0)

1 mmol/L EDTA

6.将膜暴露在X-射线胶卷或Kodak T-max 400胶卷下进行放射自显影。用水平力如一小叠书使膜和胶卷保持良好的接触。一般来说,利用T-max 400胶卷比X-射线胶卷具有更高的分辨率。放射自显影的时间依赖于放射性信号的强弱,通常从4小时到4天。

7.X-射线处理器中对X-射线胶卷显影。把T-max400胶卷浸入Kodak T-max显影液I中显影1分钟,将底片转移到显影终止盘中30秒后浸入Kodak快速定影液中5分钟,然后用蒸馏水洗涤5分钟。

8.在解剖显微镜下观察组织印迹中mRNA的位置。用Kodak Technical Pan Film 2415胶卷拍摄mRNA的定位模式,然后和用苯甲酸蓝染色的组织切片解剖结果比较。

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