利用寡核苷酸延伸法进行纯化DNA片段的放射性标记

   随机引物法：利用寡核苷酸延伸法进行纯化DNA片段的放射性标记

1.      在一个0.5ml的微量离心管中加入溶于30μl水的模板DNA(25ng)及1μl随机脱氧核苷酸引物（约125ng）。盖紧微量离心管，置于沸水浴中2min。

2.      将微量离心管移至冰上放置1min，4℃下离心10s使引物与模板的混合物沉降至管底，将微量离心管重新置于冰上。

3.      在引物与模板的混合物中加入：

5 mmol/L dNTP溶液          1μl

5×随机引物缓冲液          10μl

10 mCi/ml [α-³²P] dNTP      5μl

（比活性3000 Ci/mmol）  

水                         加至50μl

5×随机引物缓冲液：

250 mmol/L Tris (pH8.0)

25 mmol/L MgCl₂

100 mmol/L NaCl

10 mmol/L 二硫苏糖醇（DTT）

1 mol/L HEPES(用4mol/L NaOH调至pH6.6)

1 mol/L DTT贮存于－20℃，临用前用水稀释，使用后弃去稀释的DTT

4.      加入5单位（约1μl）的Klenow片段，轻弹管壁以混合各组分。以最大速度离心1～2s使所有液体沉降到管底。反应混合物室温下反应60min。

5.      在反应液中加入10μl NA终止/贮存缓冲液，可根据需要进行以下步骤。

NA终止/贮存缓冲液：

50 mmol/L Tris-Cl(pH7.5)

50 mmol/L NaCl

5 mmol/L EDTA(pH8.0)

0.5% (m/V) SDS

贮存放射性标记的探针于-20℃以备杂交用。

或

通过离心柱层析分离放射性标记的探针与未结合的dNTP或以乙酸铵和乙醇选择性地沉淀放射性标记的DNA。如果＞50%的放射性dNTP已在反应中掺入，可不进行该步骤。

另法

1．1.5ml微量离心管内依次加入：

10～200ng模板DNA（溶于1～9μl水）

灭菌双蒸水加至9μl

2．离心管加热至100℃ 5min即置入冰浴，短暂离心。

3．冰浴上依次加入：

2μl 10×反应缓冲液

1μl 0.5 mmol/L dATP（终浓度25μmol/L）

1μl 0.5 mmol/L dGTP（终浓度25μmol/L）

1μl 0.5 mmol/L dTTP（终浓度25μmol/L）

5μl α－[³²P] dCTP（终浓度0.83μmol/L）

1μl大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow大片段（2U）

4．37℃温育30min。

5．当温育反应物时，同时制备Sephadex G-50自旋转，2000×g离心2 min。

6．加入2μl 0.2mol/L EDTA（pH8.0）终止反应。反应混合液装样至自旋柱，2000×g离心4min。

7．取1μl柱洗脱液用液闪仪计数。用于杂交实验前，应将探针加热至100℃ 5min使之变性，随即置入冰浴5min。