荧光抗体的制备
2007-3-21 21:48:53 信息来源：来源网络
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1 荧光素与抗体结合（标记）
2 荧光抗体的纯化
3 荧光抗体的鉴定
1.荧光素与抗体结合方法：
⑴ 透析法：①适用于蛋白质含量低、样品体
积小的抗体溶液的标记
②标记较均匀，非特异荧光较低
⑵ 搅拌法：①适用于蛋白质含量较高、样品
体积较大的抗体溶液的标记
②标记时间短、效率较高，荧光
素用量节省
③影响因素多，非特异荧光较强
**透析法
第一步： 将含10mg/ml的Ig溶液10ml
装入透析袋。
第二步： 将上述透析袋放入烧杯中 ：
含0.1mg/ml FITC的
pH=9.4的碳酸盐缓冲液100ml。
第三步： 4℃磁力搅拌24h。
第四步： 取出透析袋，进行纯化、鉴定
**搅拌法
第一步： 将含40mg/ml BP 溶液5ml
装入反应瓶中。
第二步： 加入pH=9.0、0.5mol/L碳酸盐
缓冲液4ml
第三步： 25℃磁力搅拌下，逐滴加入
1ml含2mg的FITC溶液
第四步： 25℃下搅拌1h，4℃下继续搅拌
4h，然后进行纯化、鉴定
2. 荧光抗体的纯化：
⑴ 除去未结合荧光素
⑵ 除去标记不适当的抗体
⑶ 除去非特异反应物质
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(1)除去未结合荧光素：
A 透析法：
将标记后的抗体溶液装于透析袋，于流动的自来水中透析约10min，然后移入pH=7.4的磷酸盐缓冲 液中，在4℃下透析，直至透析外液在紫外灯下不呈现荧光为止。
B 凝胶过滤法：
葡聚糖凝胶G25或G50，用pH=7.4的0.01%PBS溶胀后装柱，加入标记后的抗体溶液，然后用上述PBS洗脱，取洗脱液加入20%三氯醋酸使蛋白沉淀后，上清液中的荧光素应低于0.01ug/ml.
(2)除去标记不适当的抗体：
采用DEAE纤维素离子柱。将DEAE纤维素用pH=7.6的0.01mol/L磷酸盐缓冲液平衡装柱，加入标记抗体溶液，进行分步洗脱。
未结合荧光素的抗体，所帶负电少，最先洗出。
过量结合荧光素的抗体，所帶负电多，最后洗出。
(3)除去非特异反应物质：
将荧光抗体用同一正常组织或同种动物其它组织的组织粉预先吸收。
按100mg组织粉/ml标记抗体比例混合， 4℃磁力搅拌1h，静置1h，离心取上清液，在用50mg/ml比例重复一次。
3. 荧光抗体的鉴定：
⑴ 抗体含量测定：双扩法
⑵ 结合比率(F/P)测定：
分光光度法，并按下式计算：
FITC: F/P=2.87×A495/(A280-0.35×A495)
RB和TRITC: F/P= A515 / A280
* F/P值高则抗体分子结合的荧光素多。
* 固定标本染色以F/P=1.5左右为宜
* 活细胞染色以F/P=2.4左右为宜
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