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qiagen大量抽提质粒（每次质粒1.5mg以上）心得
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qiagen的大量抽提试剂盒是公认效率最高，得率最高的产品。
我做的研究工作主要是基因治疗，抽提质粒是一件非常痛苦的事情。因为要做动物的体内实验，每只动物每次需要将静脉注射50微克的质粒，重复注射三次，每只就是150微克，如果有60只就需要9mg。如果需要大量抽提质粒的实验人员就清楚这9mg是需要多大的工作量。并且需要提出的是静脉注射动物用的质粒是需要去内毒素的，目前去内毒素最好得率最高的非qiagen莫属。该公司的 endofree plasmid purification 是国外文献最常用的大量抽提质粒的产品。其中以maxi,mega最为常见。
我就我自己最常用的mega使用的经验说一下。在qiagen 公司的可以下载到非常详细handbook，http://www1.qiagen.com/literature/handbooks/INT/plklit.aspx
其中非常专业及丰富的质粒的知识，对于每一个初学者是必需通读一遍的，同样对于其他人员也是很有帮助的。要有高产率高质量的质粒，以下几个关键点要注意：
1. 准备好需要的器材，根据qiagen的mega 的protocol，是需要与tip相连的广口瓶，口径是45mm这是因为tip必需与这种瓶才能配套，对于操作抽真空过滤这一步可以方便快速，减少不必要的麻烦。
2. 质粒最好是高拷贝的，感受态细菌最好是极高拷贝的。如top 10等，DH5-alfa稍差一些。感受态细菌最好是刚做不久的。
3. 每次培养的菌体量在600ml以下，LB注意水质一定要好，一定要PH值在7.2－7.4，摇床在250转/分钟，16小时以上，注意菌体的浓度一定要浓。
4. 操作过程一定要按照操作说明的时间，严格操作。要注意一点加入酸中和后在tip的时间要短，因此需要快速抽真空，快速的转入下一步。
5.洗脱的时间很长，要有耐心，不要让下流的洗脱液停止。
6.异丙醇沉淀DNA后离心可在20000转/分，离心45分钟可以提高约20％产量。
7.离心管最好是圆底而且透明的，这样不会离心破裂，也方便操作。
8.在弃去异丙醇及乙醇是一定要预先做好质粒沉淀的大致位置，这样不会导致质粒被弃去。
9.溶解DNA时注意溶液体积稍小于handbook上的说明，最好进行第二次溶解，再混合。
相信注意了以上细节，你会得到的质粒每次在1.5mg以上。
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