酵母β－半乳糖苷酶的测定

1）  粗提取物测定

1．在适当温度下（通常30℃），用适当培养液将5ml细胞培养物培养到浓度为1×10⁷～2×10⁷细胞/ml。如果自主复制质粒的杂合基因表达，可使用一种适当培养基对存在质粒的菌株进行筛选。

2．在冰上冷却细胞，离心收集。注意：以下步骤保持细胞在冰上。

3．弃上清液，将细胞悬浮于250μl裂解缓冲液中，然后置－20℃冻结，以备的第二天测定。以下步骤均在1.5ml离心管中进行。

裂解缓冲液：

100 mmol/L Tris-HCl (pH8)

1 mmol/L 二硫苏糖醇

20％ 甘油

4．若细胞冻结，可在冰上将其冻结。加玻珠恰好到液面下，再加12.5μl PMSF母液。

5．以高速振荡混合6次，每次15秒，间歇时放在冰上。

6．加入250μl的裂解缓冲液，用1000μl移液器插到离心管底部抽打使其充分混匀。

7．离心15分钟澄清提取物。如果活性成分存在于颗粒状碎片中，则可用未澄清的上清液，而测定的混合物将在步骤8澄清。

8．测定：

a.       加10～100μl抽提物到0.9ml的Z缓冲液中，用裂解缓冲液定容至1ml。

Z缓冲液：

16.1 g   Na₂HPO4•7H₂O

5.5 g    NaH₂PO4•

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