http://www.bioon.com 生 物 谷 网 站因而在细胞凋亡的研究中被广泛采用。

六、Caspase-3活性的检测
Caspase家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用，其中caspase-3为关键的执行分子，它在凋亡信号传导的许多途径中发挥功能。Caspase-3正常以酶原（32KD）的形式存在于胞浆中，在凋亡的早期阶段，它被激活，活化的Caspase-3由两个大亚基（17KD）和两个小亚基（12KD）组成，裂解相应的胞浆胞核底物，最终导致细胞凋亡。但在细胞凋亡的晚期和死亡细胞，caspase-3的活性明显下降。
　1 Western blot 分析Procaspase-3的活化，以及活化的Caspase-3及对底物多聚（ADP-核糖）聚合酶[poly（ADP-ribose）polymerase，PARP]等的裂解。
　　方法：
　　收集细胞→PBS洗涤→抽提细胞裂解液→蛋白定量→SDS-PAGE电泳→硝酸纤维素膜或PVDF膜转移→5%脱脂奶粉封闭，室温1.5~2h或4°C过夜→Caspase-3多抗或单抗室温反应1~2h或4°C过夜→TBS-T（含0.05% Tween 20的TBS）洗3次，5~10min/次→HRP-标记的羊抗鼠IgG或AP标记的羊抗鼠IgG室温反应1~2h→ TBS-T洗3次， 5~10min/次?→ECL显影或NBT/BCIP显色。
　　结果：[图8-1、图8-2]
　　2 荧光分光光度计分析
　　原理：活化的Caspase-3能够特异切割D1E2V3D4-X底物，水解D4-X肽键。根据这一特点，设计出荧光物质偶联的短肽Ac-DEVD-AMC。在共价偶联时，AMC不能被激发荧光，短肽被水解后释放出AMC，自由的AMC才能被激发发射荧光。根据释放的AMC荧光强度的大小，可以测定caspase-3的活性，从而反映Caspase-3被活化的程度。
　　方法：收获细胞正常或凋亡细胞?PBS洗涤?制备细胞裂解液?加Ac-DEVD-AMC（caspase-3四肽荧光底物）?37°C反应1h?荧光分光光度计（Polarstar）分析荧光强度（激发光波长380nm，发射光波长为430-460nm）。
　　结果：[图9]
　　3 流式细胞术分析
　　方法：收获细胞正常或凋亡细胞?PBS洗涤?加Ac-DEVD-AMC?37°C反应1h?UV流式细胞计分析caspase-3阳性细胞数和平均荧光强度。
　　结果：[图10]

七、凋亡相关蛋白TFAR19蛋白的表达和细胞定位分析
　　TFAR19（PDCD5）是由本研究室在国际上首先报导的一个拥有自己知识产权的人类新基因，前期的功能研究表明，它是促进细胞凋亡的增强剂。利用荧光素（FITC）标记的TFAR19单克隆抗体为探针，对细胞凋亡过程中TFAR19蛋白的表达水平及定位研究发现，凋亡早期TFAR19表达水平增高并出现快速核转位现象，伴随着细胞核形态学的变化，持续较长时间，在凋亡小体中仍然可见。同时我们发现，凋亡早期TFAR19蛋白的核转位早于磷脂酰丝氨酸（PS）外翻和细胞核DNA的片段化，提示TFAR19蛋白的核转位是细胞凋亡更早期发生的事件之一。进一步的研究证明，凋亡早期TFAR19的核转位具有普遍意义，不同细胞凋亡早期均出现TFAR19高表达和核转位。这为研究细胞凋亡早期所发生的事件，提供了一种新的技术和指标。
（一）TFAR19蛋白的细胞定位分析
　　材料试剂：
FITC标记的单克隆抗体，pH7.4 、0.15Mol/L PBS，3%的多聚甲醛，PBS-T（pH7.4 、0.15Mol/L PBS 含0.2% Tween 20），胎牛血清，荧光细胞洗液：pH7.4 、0.15Mol/L PBS含2%胎牛血清及0.1%NaN3 。FACS管，Tip头，移液器。
　　仪器：低温水平离心机, 37°C水浴箱，荧光显微镜，共聚焦激光扫描显微镜，流式细胞计
　　方法：
　　1 悬浮细胞的染色：
　　（1）收获正常和诱导凋亡的细胞（0.5~1′106），PBS洗2次，1000rpm′10min。
　　（2）3%多聚甲醛冰浴10min，PBS洗2次，1000rpm′10min。
　　（3）加入PBS-T溶液，37°C孵育15min，PBS洗2次，1000rpm′10min。
　　（4）加入200ml胎牛血清，室温反应30min。
　　（5）加入5ml FITC标记的TFAR19单抗（终浓度为1：40），4°C反应30min
　　（6）荧光细胞洗液洗2次，1000rpm′10min。
结果观察：将细胞沉淀滴片，荧光显微镜及共聚焦激光显微镜下观察TFAR19在细胞中的定位。同时用流式细胞计定量检测TFAR19蛋白的平均荧光强度。[图11]
　　2：贴壁细胞的原位染色
　　（1） 贴壁生长的对数期细胞铺在24孔或6孔板中（内有洁净盖玻片），让其爬片生长，待长到
50%~80%满时，凋亡诱导剂处理细胞。
　　（2） 将不同时间点处理的细胞进行免疫荧光染色，染色步骤同上。
　　（3） 将染色的爬片细胞放于一张滴有少量甘油（5ml）的载玻片上，荧光显微镜或共聚焦激光扫描显微
镜观察TFAR19在细胞中的定位。
　　结果观察：[图12]
　　3：临床病理切片的染色、检测。
　　4：原代细胞的培养、检测。
　　5：分析TFAR19蛋白在人体内各组织器官的分布及定位
（二）TFAR19蛋白的表达与临床疾病
1． ELISA法检测正常人和疾病状态下，以及疾病的不同时期，血清中TFAR19蛋白水平及其TFAR19自身抗体水平。
　　材料和试剂：
　　1. 包被Buffer: pH9.6, 0.05Mol/L碳酸盐Buffer
　　2. 洗涤液： pH7.4, 0.15Mol/L PBS 含0.05% Tween 20
　　3. 封闭液： 3%BSA（用洗涤液配制）
　　4. 酶标抗体的稀释：用封闭液稀释
　　5. OPD底物Buffer：Na2HPO4.12H2O 1.84g
柠檬酸 0.51g
DDW 100ml
　　6. 显色液（现配现用）：底物Buffer 10ml
OPD 2mg
30% H2O2 2ml
　　7. 终止液 2Mol/L H2SO48. 重组人TFAR19, HRP标记的羊抗人IgG9. ELISA板, Tip, 移液器，ELISA
Reader（OD490nm），洗板机
　　操作步骤
　　1. 用包被Buffer稀释的重组人TFAR19（1mg/ml）包被ELISA板, 100ml/well, 37°C孵育2h或4°C过夜（一般24h以上）。
　　2. 洗涤Buffer洗板三次，加入封闭液，200 ml/well ， 37°C孵育2h或4°C
过夜。
　　3. 洗涤Buffer洗板三次，加入不同稀释度的病人血清（3个重复孔）100ml/well ，37°C孵育1h。设包被Buffer、洗涤Buffer 、封闭液为阴性对照。
　　4. 洗涤Buffer洗板三次，加入1：2500稀释的HRP标记的抗人IgG, 100ml/well，37°C孵育1h。
　　5. 洗涤Buffer洗板三次，加入显色液，100 ml/well，避光反应10~15min。
　　6. 加入H2SO4终止反应，50 ml/well。
　　7. ELISA Reader 读取OD490 光密度值，分析和比较病人血清和正常血 清中TFAR19自身抗体的表达水平。

2． Western blot 分析原发性肿瘤细胞和正常细胞的TFAR19蛋白的表达水平。

◆ 细胞凋亡与肝病（一篇综述）

摘要：细胞凋亡是能量依赖的细胞内死亡程序活化而致的细胞自杀。细胞凋亡偏重于凋亡小体的形态学的变化过程，并且可见于许多非生理状态，如疾病所引起的细胞凋亡和抗癌药物所引起的癌细胞死亡等，而程序性细胞死亡则偏重于其分子生物学和生理性功能，一般指生理性死亡。近年来有关肝病凋亡的论文发表量日益增多，本文就此进行综述。
一 、细胞凋亡的特征和检测方法
细胞凋亡在形态学上有四大特征：1）、细胞变圆，2）、胞浆起泡，3）、核固缩，4）、凋亡小体形成。形态学观察到凋亡小体是细胞凋亡的金标准，但此法并不敏感。（1）琼脂糖凝胶电泳对凋亡细胞基因组进行分析发现其DNA片段呈180-200bp的阶梯状的电泳条带。检测出这种典型的电泳条带是细胞凋亡的可靠指标。（2）近年来用于检测细胞凋亡的技术还有 TUNEL 法，通常认为其对细胞凋亡数量的估计过高。（3）因此在研究细胞凋亡时应尽可能的做琼脂糖凝胶电泳作为对照。另外还有流式细胞仪法测凋亡细胞峰法，通常认为它可以测定细胞凋亡的数量，并能够将坏死细胞、活细胞区分开来，是一种比较好的检测方法。可进行定量半定量的分析。（4）
在肝脏凋亡小体被认为就是Councilman 小体、嗜酸性小体和固缩坏死。（5）并且发现肝脏凋亡发生迅速，可在几分钟、几小时内完成。通常凋亡细胞的清除是一个不伴有炎症的过程，因为细胞内的内容物被膜包裹形成凋亡小体而被枯否细胞、临近的肝细胞清除，细胞内的酶不外溢。这通常是对的，然而肝细胞的凋亡并非人们所想象的那样隐蔽而不容易被发现，在肝细胞的凋亡过程中可以检测到细胞内酶，并且当凋亡的肝细胞的数量超过肝组织的清除能力时，组织结构的丢失将会发生炎症，因此细胞凋亡在过去认为由细胞坏死触发的许多疾病中可能起重要作用。（6）
二、细胞凋亡的机制
在凋亡的过程中，凋亡启动阶段可以与凋亡执行阶段区分开来，在执行阶段 Caspases( 一组新的特异性水解底物天冬氨酸残基的半胱氨酸蛋白酶家族)，可以依次激活来水解细胞和裂解一些关键的蛋白。Caspases通常以酶原Procaspases的形式存在于细胞胞浆内，需要蛋白酶先将其裂解为有功能的蛋白酶的形式才可发挥作用。并且现在认为Procaspases具有Caspases的活性，但其活性较Caspases为低。如Procaspase-8具有活化Caspase-8 1%~2%的活性。所以Procaspase-8相互聚集时可以自我激活或相互激活为Caspase-8。Procaspases的相互聚集可由结合调节分子介导,如CARDs(caspases recruitment domains) 和DEDs(death effector domains)，CARDs和DEDs与Fas 和p75NGF 受体死亡区域具有相似的结构（6个折叠闭环，两歧性反向平行的α螺旋）。因此Procaspases可以相互聚集形成“apoptosome”来激活 Caspases。之后Caspases可将蛋白从天冬氨酸盐羟基端一分为二。同时Caspases自身也是通过对其天冬氨酸残基进行裂解而激活。通常认为Caspases是通过其他的Caspases的裂解而激活。Caspases激活Caspases的过程会导致Caspases的级联放大反应。Caspases(-3，-6，-7)被认为是Caspases中下游的Caspases，并且是分解底物的关键酶，是细胞凋亡的执行者。近来已发现两条激活Caspases的通路。一条涉及到死亡因子和死亡受体，另一条与线粒体功能障碍有关。(7)
死亡受体是肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）超家族的成员。到目前为止共发现8种死亡受体，其中TNF受体1（TNF receptor-1,TNF-R1）和Fas（又称CD95/APO-1）白被研究的最多，它们均通过其配体而被激活起作用。Fas和TNF-α可以动员细胞内不同的死亡复合体伴随的调节蛋白和procaspases 而活化死亡复合体，然后由死亡复合体激活一系列的上游Caspases，最主要的是Caspase-8,由它激活下游的Caspases 蛋白酶来执行促使细胞凋亡的作用。(7、8)
在第二条通路，细胞应激可以促发细胞色素C从线粒体上脱落，这通常可能是通过线粒体内膜的通透性改变而介导的。脱落的细胞色素C与　Apaf-1结合后而激活Caspase-9, Caspase-9然后激活下游的Caspases执行促使细胞凋亡的作用。(7)近来的资料表明线粒体和死亡复合体可以通过Bid蛋白联系起来，Caspase-8激活Bid蛋白，Bid蛋白随后可以诱导线粒体释放细胞色素C。Bid 蛋白是Bcl-2家族的一员。目前还发现其它几种胞浆蛋白参与细胞凋亡的调节，主要是 Bcl-2的家族成员。目前在哺乳动物中已鉴定出至少１５种Bcl-2蛋白。它们可以分成两大类：促进细胞凋亡的，如Bax、Bak、Bok Bcl-xS、Bag、Bid

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