发光细菌毒性检测的研究和应用

德国政府的相关法规及应用

化学工业的废水、填埋场渗出液和工业冷却水必须通过发光细菌的毒性测试。同时，德国联邦环境部门正在起草制定合适的指导性技术，从而对其他的工业部门进行监督。发光细菌试验是取代鱼类毒性试验的方法之一，并且已在Bavarian地区进行了试点。

发光细菌试验是环境样品毒性检测的生物测试技术，并已被列入德国国家标准(DIN38412)和国际标准(ISO11348)。毒性是一项综合的生物学参数，它是衡量样品对活性生物体所产生的影响，不能以化学分析的方法进行测定，而其他的生物测试方法如鱼类试验、浮游动物试验、藻类试验等则较为复杂，且必须使用高等生物进行试验，从而引起众多的争议。发光细菌测试使用了具有发光特性的天然微生物，而毒性物质则将抑制起发光，且毒性越强光抑制越明显，这一方法经研究被证实具有快速、简便的特点，同时有很好的灵敏度和可靠性。另外，发光细菌本身没有危害性。

发光细菌毒性检测的整个过程在60分钟之内，发光抑制率通过测定起始和终止状态时的细菌发光值并计算得到，测试的结果有如下两种：

l        光抑制率，通过计算直接测定样品的毒性

l        稀释因子G_L，在DIN的分析中，将样品稀释成系列浓度并测定每个稀释浓度的抑制率，其中造成20%或20%以下抑制率的样品稀释度即为G_L

 德国水管理法(WHG)规定对填埋厂渗出液和工业冷却水进行发光细菌毒性测试，这些废水的毒性将造成严重的问题，如生物污水处理系统和地表水的破坏，因此，WHG明确规定了废水排放的毒性限制：

l        填埋场渗出液经常具有较严重的污染，G_L=4

l        工业冷却水的污染部分是由于生物杀灭剂，G_L=12

l        现在起，化学工业的废水也被规定进行发光细菌毒性测定，G_L=32

废水监测的目标是含盖90%以上的部门，包括医院废水（其中被发现存在毒素），大量使用清洁剂和表面活性剂的部门（如食品和饮料业），石油工业等。根据WHG的规定，必须对20个以上的部门所排放的废水以鱼类试验进行毒性监测，Bavaria地区于1993年起采用了发光细菌和Daphania的试验代替鱼类试验，该模式现在已被全德国所接受，其结果等同于鱼类试验。在鱼类试验、浮游动物试验、藻类试验和发光细菌的毒性测试比较中，发光细菌法最为敏感，被测出毒性的废水比例最高。

表1. 不同工业部门发光细菌毒性检测的规定（德国联邦环境办公室，1998）

GX: 稀释因子，样品不产生毒性效应的

GF: 鱼类试验，GD: daphania试验，GA: 藻类试验，GL: 发光细菌试验

欧盟和美国的相关政府指导性文件：

欧盟关于边界河流水质控制的指导性文件：

由于毒性物质排放所造成的污染，所以需通过生物试验对环境水样、沉积物、流出物进行毒性测定，从而为环境和生态系统的安全提供早期的预警。环境样品毒性测定所选用的方法所要考虑的因素包括：方法的灵敏度、快速性，方法要能覆盖较广范围的化学毒性物质。其所列出的排放物、环境水、沉积物的毒性测试方法包括发光细菌法(Microtox)、浮游生物(D.magna)、藻类、鱼类试验等，其中Microtox方法的特点是反应快速、操作简便。

美国环保局(EPA)全废水毒性试验：污染物测定程序的指导性文件：

EPA对于排放物的控制的经典方法是实行对特定化学物质的指标限制，但是在实际的环境样品中人仍存在很多未知的化合物，另外，化合物的毒性效应是所有组成物质拮抗作用或抑制作用的综合结果，所以单纯的化学物质的限定不能为水体的安全提供充分的保障。在此情况下，EPA和各州的环保局正开始使用生物学的方法对排放物的毒性进行测定（而不是传统的毒物的化学分析），从而最终判定环境样品的综合毒性效应。EPA在1994年所颁布的“全废水毒性控制方案”即指出采用毒性指标来控制通过NPDES程序的污染物的排放。方案指出，流出物的生物毒性检测是水质控制的重要方面。关于生物试验的方法，目前有鱼类试验、浮游动物试验等，虽然Microtox试验尚未列入正式的测试方法，但EPA已经指出该方法可以作为一项毒性筛选试验，并且承认其是一种有效的毒性检测的工具。

Azur公司microtox检测系统

使用活体生物的检测技术是测定水样和土壤样品所存在和潜在毒性的唯一可靠的方法，Azur经过18年的发展，在生物毒性试验和仪器准确性结合的基础上发展了生物毒性检测系统。

使用发光细菌进行毒性检测的原因：

发光作用是发光细菌正常生理状态下所具有的性质，它是细胞呼吸作用的副产物，而呼吸作用则是细胞和生物代谢的基本过程，细菌的发光直接和其呼吸相关，当细胞活性受到毒性物质作用后，其活性将受到抑制，从而使呼吸速率下降，进而导致发光降低，样品的毒性越强，发光细菌的光损失越多，以细菌发光法测定样品的毒性已经被证明是一种方便、可靠的生物传感方法。

Microtox急性毒性检测系统概述：

该系统使用冻干的发光细菌制剂，通过15分钟的暴露试验，测定其代谢的抑制情况，从而计算出样品（水样、土壤样品）的毒性。该方法以通过工业、研究和政府的试验被证实有效，至今，已有超过500的关于Microtox系统应用和评价的论文。同时该测试方法已在多个国家被认可为官方标准，包括ASTM(D-5660)。ISO11348-3（水质测定—水样对于发光细菌的抑制效应测定）的草案也已经得到批准。加拿大已经批准该方法为常规的测试应用于石油钻井中的排水监测。另外，这一方法已被提交美国环保局作为全废水毒性测定(WET)的测试，从而作为国家污染和排放物减除系统(NPDES)中一项新方法。

Microtox试验的灵敏度：

目前，公开的数据库中已经保存了1200种以上化学物质的Microtox测试的EC50值。

Microtox试验的准确性：

Microtox试验已经进行了充分的重复性试验，包括实验室间的比较，证实其变异系数在20%以内，与化学分析方法类似，明显优于其他生物学测试。

Microtox试验的应用：

该方法已广泛、成功地应用于环境和过程的监测，具体包括：

l        污水处理场的流入液的检测，以保护活性污泥的生物活性；

l        污水处理厂的流出液的检测，以保护受纳水体的安全；

l        毒性减低评价(TRE’s)和毒性鉴定评价(TIE’s)；

l        表层水的监测以确定点源污染和非点源污染；

l        生饮水的检测；

l        沉淀物的测定；

l        土壤污染的检测及其恢复过程的监测；

l        工业过程中水体中生物杀灭剂的检测

关于使用Microtox试验进行饮用水监测的情况：

使用Microtox试验监测饮用水的原因：

Microtox试验是建立在生物传感器基础上的毒性检测系统，它能有效地检测突发性或破坏性的水源污染，已有多个国家将该系统应用于饮用水的监测。在美国，城市中偶发的和蓄意性的污染特别引起关注，本方法可以在15分钟内快速地完成检测，从而对水质的变化作出最迅速的反应，另外，Microtox试验快速筛选结果的可靠性及其操作的简便性、成本的合理性也使之成为重要点源上水质的常规监测的有效手段。

Microtox试验对特定情况下的饮用水的检测：

美国军队的供水系统和华盛顿地区的供水管道都使用该检测方法对饮用水进行监测，从而保护平民和军事人员免受引水污染的危害。

1984年洛山矶和1996年亚特兰大奥运会期间、1991年海湾战争以及2000年民主党全国代表大会期间都采用了该方法对饮用水的处理和分配系统进行连续的监测，以保证饮水的安全。

Microtox试验的检测范围：

经过近20年的科学研究，已经证明该方法对数千中不同类型的化学物质具有敏感的效应，其反应的毒性物质包括重金属、农药、真菌杀灭剂、杀鼠剂、有机溶剂、工业化合物等，下表列出了部分毒性物质及其Microtox试验的检测限