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血小板衍生的生长因子(DPGF)的检测方法

血小板衍生的生长因子(DPGF)的检测方法

1.AG1523细胞生长在含10%小牛血清的MEM培养液中。检测前用0.25%胰蛋白酶消化生长到汇合的细胞。每个35mm培养皿加入2ml3×104细胞的细胞培养液,在37 5 CO2饱和水汽二氧化碳培养箱中培养4天。洗去培养液,加2ml无血清的MCDB105培养液(钙离子浓度为0.5mmol/L)。继续培养2天。

2.6天时每个培养皿中约含有105细胞,洗去培养液。加入系列稀释的待测样品、0.1mg/ml人血清白蛋白、0.02μCi740kBq[3H]脱氧胸苷(5Ci/mmol)和无血清的MCDB105培养液,总量1ml。继续培养48小时。

3.吸去培养液,用34ml 5%三氯醋酸(w/v)溶液固定细胞10分钟。吸去三氯醋酸溶液,用自来水轻轻洗去固定液,室温中自然干燥。

4.每个培养皿加入0.5ml1 SDS0.3mol/L NaOH溶液,室温中溶液细胞15分钟。将溶解物转移到液体闪烁计数管中,加5ml闪烁液,在液体闪烁计数仪上计数放射性活性(cpm)。约3ng/ml0.1nmol/LPDGF即能诱导50%最大[3H]脱氧胸苷摄入。

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