免疫沉淀法和Western印迹实验
1）抗原制备
1．取5×107细胞，用TBS（50mmol/L Tris-HCl pH8.0, 138mmol/L NaCl, 2.7mmol/L KCl）洗涤，用1ml含1mmol/L PMSF的TNB（1％ Nonider P40, 1mg/ml BSA, TBS配制）悬浮沉淀细胞，置冰上30～60分钟，溶解细胞。
2．强烈混悬10秒钟（涡旋器），250×g离心10分钟，去除沉淀的细胞核。微量离心机最大速度（每分钟14 000转）离心上清液30分钟或100 000×g离心30分钟，去除沉淀物。上清液用于免疫沉淀。
2）免疫沉淀
1．每200μl抗原制剂中加入10μl兔血清-Agarose和10μl山羊血清-Agarose，在0～5℃中，缓慢旋转混合1小时，200×g离心5秒钟，去除沉淀的Agarose小珠。
2．将含抗原的上清液分成两等份，分别置1.5ml离心管中，各加TNB到1ml。一管中加1～5μl兔抗细胞因子抗血清（或1～5μl小鼠单克隆抗体腹水或50～100μl含特异性抗体的杂交瘤细胞培养上清液），另一管加入同样量的对照液（无特异性抗体的同种属血清、腹水和细胞培养上清液），4℃结合1～2小时。
3．每管加50μl第二抗体-Agarose（例如山羊抗兔IgG的抗体与Agarose的结合物）或者葡萄球菌蛋白A（或G）-Agarose，在0～5℃中，缓慢旋转混合1小时，200×g离心5秒钟，去上清液。
4．用TNB洗涤沉淀物2次、TBS洗涤沉淀物2次，每次用1ml液体，混合后200×g离心5秒钟，去上清液。加入1ml 50mmol/L pH6.8的Tris-HCl缓冲液悬浮沉淀物，将悬液转移到新的离心管中，200×g离心5秒钟，最后小心吸去全部液体。更新的离心管是为了防止粘附在离心管上的无关蛋白质溶解于下述电泳缓冲液中。
3）SDS-PAGE电泳
电泳样品的处理
向上述沉淀物中加入20μl样品缓冲液（2％ SDS，10％甘油，0.025％溴酚蓝，50mmol/L pH6.8 Tris-HCl），不要旋转混合。加热100℃ 5分钟或37℃ 30分钟或65℃ 30分钟。200×g离心15秒钟。取上清液直接电泳（非还原胶）。如果在还原胶中电泳，上清液中加入5％ 2-巯基乙醇，置37℃ 1小时后电泳。
凝胶的配制
1．在25ml容器中，按下表分别加入30％丙：双丙稀酰胺、4×分离胶缓冲液和双蒸水，混匀后用真空泵脱空气10分钟。加入10％ APS和TEMED，混匀后立即倒入玻璃夹层中，直至离上缘约1.5～2cm。小心在凝胶层上加电泳缓冲液，不要冲散凝胶，使液体和凝胶形成清晰的界面，液体可以使聚合的凝胶上缘平整。室温放置30～60分钟，让凝胶聚合。
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保存液（ml） |
15ml分离胶中丙稀酰胺的终浓度（％） | |||||||
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5 |
7 |
8 |
9 |
10 |
12 |
13 |
15 | |
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30％丙：双丙稀酰胺 |
2.50 |
3.50 |
4.00 |
4.50 |
5.00 |
6.00 |
6.50 |
7.50 |
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4×分离胶缓冲液 |
3.75 |
3.75 |
3.75 |
3.75 |
3.75 |
3.75 |
3.75 |
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双蒸水 |
8.70 |
7.70 |
7.20 |
6.70 |
6.20 |
5.20 |
4.70 |
3.70 |
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10％APS |
0.05 |
0.05 |
0.05 |
0.05 |
0.05 |
0.05 |
0.05 |
0.05 |
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TEMED |
0.01 |
0.01 |
0.01 |
0.01 |
0.01 |
0.01 |
0.01 |
0.01 |
2．配制浓缩胶：取10ml试管，加入0.6ml 30％丙：双丙稀酰胺（终浓度3％）、1.5ml 4×浓缩胶缓冲液和3.9ml双蒸水，混匀后用真空泵脱空气10分钟。加入25μl 10％ APS和5μl TEMED，混匀后立即倒入玻璃夹层中，加满。将样品梳小心插入浓缩胶中，样品梳的下缘分离胶上缘约0.5～1cm。室温放置30～60分钟，让凝胶聚合。
3．小心取下样品梳，用电泳缓冲液小心洗样品孔，冲去游离的凝胶，在孔中加满电泳缓冲液。小心将玻璃板装到电泳装置上。用双蒸水稀释电泳缓冲液至1×，加入电泳槽，使缓冲液浸没凝胶。
4．用微量注射器吸取样品，小心插入样品孔，将样品加入孔中，注意不要使样品溢出。每加一个样品后，要冲洗注射器防止交叉污染。留一个样品孔加入分子量标准。如果有空的样品孔，也要加入等量的样品缓冲液。电泳50～120V。待溴酚蓝达到凝胶的底部，或预定的分子量标准达到分离胶的中间，即可停止电泳。
5．取下玻璃板，置电泳缓冲液中，小心分离凝胶。此凝胶可以直接进行Western转移，或用考马斯亮蓝染色或用银染色。
4）Western印迹实验
电泳转移
1．将上述电泳的凝胶置转移缓冲液（下述）中平衡至少30分钟。按厂家的说明书安放凝胶和膜：在塑料支撑上依次放上浸湿转移缓冲液的海绵垫、一张与凝胶同样大小的用转移缓冲液浸湿的滤纸（Whatman 3MM）、凝胶、比凝胶略大的NC膜、另一张浸湿的滤纸、浸湿的海绵垫和塑料支撑。在放置凝胶、NC膜和滤纸时一定要驱出它们之间的气泡，在放凝胶、膜或滤纸以前先加一点缓冲液可减少气泡产生，用吸管在凝胶、膜、滤纸上轻轻滚动可驱除气泡。
2．将电泳装置固定，置电泳槽中，膜应当在阳极一边。加入转移缓冲液，在4℃，100V电泳30～60分钟，或14V电泳过夜。
3．转移完成后，剪角标记膜的方向，自然干燥。干燥的膜可在4℃中密封保存1年以上。在免疫染色前，PVDF膜要先用100％甲醇润湿，再用双蒸水洗去甲醇；其它膜直接用双蒸水润湿。凝胶应当染色观察转移的效果，膜也可以染色。
半干转移
1．用转移缓冲液平衡凝胶、膜和滤纸。
2．半干转移装置的底板是阳极，在底板上依次放上：三张预湿的滤纸（Whatman 3MM）、NC膜、凝胶、三张预湿的滤纸。每一层都要驱除层间的气泡。小心盖上顶板，接通电源。转移1小时左右。凝胶表面温度不要超过45℃，如果温度过高，应减少转移电泳的电流。
3．转移完成后，剪角标记膜的方向，自然干燥。干燥的膜可在4℃中密封保存1年以上。在免疫染色前，PVDF膜要先用100％甲醇润湿，再用双蒸水洗去甲醇；其它膜直接用双蒸水润湿。凝胶应当染色观察转移的效果，膜也可以染色。
免疫染色
1．将膜置封闭液中，室温摇晃30～60分钟，封闭非特异性结合位点。
2．用封闭液稀释特异性抗体，根据抗体的量预先确定稀释度，通常1：100～1：10 000之间。将膜从封闭液中取出，置抗体稀释液中，室温摇晃反应30～60分钟。用封闭液洗涤膜4次，每次10分钟。
3．用封闭液稀释结合碱性磷酸酶（或辣根过氧化物酶）的第二抗体，根据抗体的量预先确定稀释度，通常在1：200～1：2 000之间。将膜置酶标记抗体稀释液中，室温摇晃反应30～60分钟。用封闭液洗涤膜4次，每次10分钟。
4．用50ml TBS洗涤膜，去除磷酸和Tween 20。在底物液中显色10～30分钟，注意观察显色情况。显色完成后，用大量双蒸水洗涤膜终止反应。观察结果并照相。
