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人类基因组草图的绘制完成及深入研究将为基因治疗打下坚实的基础，基因治疗已成为世界上最活跃的研究领域，基因治疗药物将对医药工业产生深远的影响。自从1990年Anderson等首次成功地进行基因治疗的临床研究以来，迄今已完成了500多例基因治疗临床研究，但其结果尚不尽人意，其最大困难在于开发无毒、高效的基因治疗载体。虽然80%的研究仍采用转染率较高的病毒载体，但尚存在的非导向性、有限的携带能力、生产和包装以及安全性的困扰等问题，如2000年美国宾州大学以重组病毒为载体的基因治疗药物在临床研究中造成一个18岁受试者死亡的悲剧以及腺病毒有选择性的促肾上腺皮质作用的报道，因此，近年来非病毒基因治疗载体倍受关注，也正是当前药剂学研究的前沿课题。为此，本文就其研究进展作一概述。
1 裸DNA
将目的基因连接在表达的质粒或噬菌体中直接注射而不依赖其它物质的介导，是最简单的非病毒载体系统。已知皮肤细胞、某些肿瘤细胞及免疫细胞对裸DNA较为敏感。肌内注射后可直接诱导相应的免疫反应，也可检测到DNA的明显表达。电穿孔（electroporation）技术和微粒子轰击法（microparticle bombardment, 此法也称作基因枪）的出现，大大提高了裸DNA的转染效率，而且使DNA可直接到达细胞核，避免了各种酶对DNA的降解。目前使用的DNA疫苗，就是用编码病毒抗原的质粒直接肌内注射，可获得有效的抗病毒免疫。虽然将裸DNA直接用于病变组织是可行的基因转移策略，但是，对于解剖学上不能进入的部位如器官里的实体瘤，显然给予裸DNA是无效的。最近，Yoshiakit等还使用高频、低强度的超声波转染荧光素酶质粒DNA到培养的人血管平滑肌细胞和内皮细胞。结果显示，在这两种细胞中的荧光素酶活性显著增加。同样用超声法把抗原癌基因（P53）质粒DNA转染到兔颈动脉以治疗血管损伤后再狭窄，结果表明P53蛋白显著增加，且没有明显的不良反应，如炎症反应。
2 脂质体或脂质复合物
自从1987年Felgner等率先用脂质体作为基因转移载体以来，相继合成了许多阳离子脂质。所有这些阳离子脂质的一端皆拥有1～2条由12～18个碳原子组成的疏水链，使其在水性介质中形成双层结构，并包裹DNA；另一端为亲水性的N＋头部，通过静电力与DNA结合以形成脂质复合物。构效关系研究表明，增加分子中N＋数目以及N＋与疏水链的距离，则有利于基因转移。脂质体或脂质复合物经静脉注射后，很快被血浆清除以及在肺组织中积蓄，蛋白质表达主要在肺内皮细胞，表达时间短，一般在给药后4～24 h达峰，1周后消失。因此，阳离子脂质载体在治疗一些肺部疾病如肺代谢性疾病、门脉高压和急性呼吸窘迫综合征等有较好前景。脂质体或脂质复合物也可直接应用于病变部位以避免静脉给药的靶向困难，如：气管内给药可使肺泡上皮细胞中的 b-半乳糖苷酶基因表达，给予P53凋亡诱导基因可使早期肺肿瘤缩小。另外，通过喷雾给药可有效地防止脂质复合物中DNA的降解。还报道用单糖、双糖或PEG作冻干保护剂，采用冷冻干燥法可改善脂质复合物的稳定性。虽然，在阳离子脂质构效关系研究的基础上，合成了一些新的脂质载体，但离理想的脂质载体还相距较远，其困难在于体内外转染条件的差别，而且转染效果还取决于给药途径。为此，一个理想的载体不得不根据实际的临床应用而个性化设计，这无疑给载体的开发带来困难。脂质体或脂质复合物已在临床研究中用于治疗癌症和囊性纤维病变，但还无长期安全性报道。早期的动物和临床研究表明，脂质体或脂质复合物是无毒的，而且若给予小剂量，其诱导的炎症反应很小。然而，现在有研究表明小鼠呼吸道吸入脂质复合物后，可诱导产生剂量依赖性的肺部炎症反应并伴随细胞因子的产生。若静脉注射给予DNA阳离子脂质复合物，发现可激发高水平的细胞因子如 INF-g 和TNF-a 产生。这些细胞因子不仅引起所治疗小鼠的毒性，还抑制外源基因的表达。阳离子脂质起一个协同作用，诱导细胞因子产生的主要成分是质粒 DNA中未甲基化的胞苷磷酸鸟苷（cytidyl phosphate guanosine, CpG）二核苷酸。目前，解决上述问题的办法在于修饰质粒DNA以减少CpG数目和使用免疫抑制剂。另外，增加载体的组织特异性和降低含CpG DNA与免疫细胞的非特异性相互作用，也能降低免疫反应的发生。
3 聚合物
3.1 聚-L-赖氨酸
1987年首次报道与去唾液酸糖蛋白连接的聚-L-赖氨酸偶合物用于肝细胞的基因靶向转移。聚合物用作基因载体的早期研究工作主要集中在如何偶联上靶向配体或抗体以增加靶细胞的摄取。研究发现，如果既不连接靶向配体或抗体，又不添加吞噬泡或溶酶体溶解剂（如氯喹），其基因转染效果较阳离子脂质体差，这是双亲性阴离子脂质与可溶性聚合物——聚-L-赖氨酸的重要区别。这种聚合复合物（polyplexes）的细胞摄取和基因转染在有或无靶向配体的情况下，皆依赖于聚合复合物正电性的存在。将组氨酸连接到聚-L-赖氨酸中L-赖氨酸的d-残基上形成的聚合物比添加了氯喹的聚-L-赖氨酸混合物更有效，这是由于在 pH 6以下，质子化的组氨酸提供了额外的内吞缓冲能力。因此，组氨酸的使用似乎有助于避免DNA在吞噬泡中被降解。研究还表明，用半胱氨酸和色氨酸残基替代聚-L-赖氨酸中的一些氨基酸残基，也会增强此聚合复合物的基因转染效果，表明DNA的释放可能受细胞内二巯键的还原所激发。虽然，聚-L-赖氨酸像脂质体一样能阻止血清中核酶对DNA的降解，但是，若经静脉注射，聚合物与血浆蛋白结合后仍将迅速从血浆中清除。
3.2 聚乙烯亚胺（polyethylenimine，PEI）
与聚-L-赖氨酸不同的是这种支链或线形PEI阳离子聚合物由于其自身的内吞缓冲特性，在不需要吞噬泡或溶酶体溶解剂的情况下显示出更好的基因转染效果。PEI和阳离子脂质体一样也具有细胞毒性作用，不同相对分子质量（Mr）或异构体(支链或线形)的PEI，在体内基因转染的效果和毒性是不同的。PEI的Mr对转染活性的影响报道不一，可能理想的Mr大约在19.9 ´ 103～70.0 ´ 103。 PEI是一种非常有效的基因转移载体，但若静脉给药，其基因表达跟阳离子脂质体一样也主要在肺泡上皮细胞，因此，以前的研究多采用直接应用到靶组织。PEI已用于不同给药途径的基因转移如吸入、肾动脉内给药、脑内注射和静脉注射，其基因表达也较短暂，给药后 14天已不能检出。如果在此聚合物偶联上靶向配体将会增强其转染能力。若用PEG包衣能使其在肺外组织、肝的基因表达增加，而且还能调节PEI的毒性，但是体外摄取有所降低。不论是静脉注射，还是气管内给药，线形PEI的基因表达量皆优于阳离子脂质体。
3.3 树状聚合物
一定分子量范围的聚酰胺和含磷树状聚合物已被用作基因传递系统，其末端氨基通过静电力与DNA结合，增加末端氨基的数目则能增加其基因转染的效果。聚酰胺树状聚合物的酰胺键在水或乙醇中的水解，可使基因转染率增加50倍，其原因可能是增加了聚合物的柔韧性。研究还发现，这种增加的柔韧性对吞噬泡的膨胀至关重要。一些可水解的聚酰胺树状聚合物对体内颈动脉的基因转染比支链PEI更有效。
3.4 其它聚合物
聚（二甲氨基）乙基甲基丙烯酸酯、聚-L-组氨酸、聚乳酸-乙醇酸共聚物、壳聚糖、明胶等皆被用作基因传递系统的载体材料。纳米粒由于它的超微小体积，能穿透组织间隙，具有良好的细胞摄取效果而将DNA导人到胞浆内；能控制DNA的释放而延长其体内、外的作用，因此，纳米粒作为基因转移载体得到了广泛的关注和研究。壳聚糖纳米粒是首次报道的口服基因传递系统的载体材料，这将为口服疫苗提供新的机遇。李拥军等用聚乳酸-乙醇酸共聚物和聚乙烯醇包载特异性反义单核细胞趋化蛋白-1基因制得的纳米粒，在体外的释放时间为2周左右，可将目的基因转移至平滑肌细胞基因组中，其效果与阳离子脂质体相当；体内可实现局部基因转染和表达，发挥相应的效应，其作用比阳离子脂质体介导的基因转染稍强；但该载体的包理率仅有0.9%。Goetting等在用带正电荷的聚苯乙烯纳米粒装载带负电荷的寡核苷酸的实验中，测定了寡核苷酸的含量对纳米粒稳定性的影响。结果表明，随着寡核苷酸含量的增大，所形成的纳米粒先变得不稳定，后趋于稳定。这是由于纳米粒的极性造成的，而当纳米粒达到电中性时，凝固作用也达到最大。另外，研究还表明，转基因纳米粒对靶细胞的转染效果与细胞类型、纳米粒的粒径大小、细胞孵育的时间以及纳米粒的浓度有关。
4 复合载体
4.1 脂质复合物
将DNA与聚-L-赖氨酸、聚乙烯精胺或聚乙烯咪胺等形成复合物，再包封于阴性或中性脂质体中形成的脂质复合载体系统毒性更小，而且在某些情况下，由于更大程度上保护DNA免遭核酸酶降解而在体外基因转染中比阳离子脂质体更有效。脂质体或脂质复合物、聚合物或复合载体一般可以通过以下手段以增强载体的靶向性和提高转染率。①由于阳离子脂质或聚合物是通过静电力与DNA形成复合物，只有在阳离子过量时才能有效地浓聚DNA，而这种正电荷在体内易与血浆蛋白（特别是白蛋白）相互作用并激活补体系统，从而引起复合物的去稳定性、非特异性清除及不良反应。因此，通过PEG修饰、包裹或羟丙基甲基丙烯酸包衣后的脂质复合物或聚合复合物体，可屏蔽复合物所带的电荷，减少它与血浆成分的相互作用，从而避免免疫系统的清除，增加循环时间；减少与非靶细胞因电荷引起的相互作用；聚合物——质粒DNA复合物多呈不规则状，包裹或包衣后可使其成为球形结构；增加靶组织中蛋白质的表达，但体外的细胞摄取量有所降低。②通过共价或非共价连接靶向抗体或配体如：肝细胞特异性的去唾液酸糖蛋白、肿瘤细胞特异性的转铁蛋白等来增加靶组织细胞中的转染率。
4.2 拟病毒颗粒
用中性或阴性脂质体包裹偶联有核定位肽、两性分子肽的阳离子多聚物——DNA复合物，再加入未端有跨膜型疏水区的配体寡肽，插入脂质体双分子层中，形成一个功能齐全且有保护作用的穿梭载体，类似于病毒颗粒。这种拟病毒颗粒一般应用中性或阴性脂质体，因阳离子脂质体在血浆中不能维持胶体的稳定性。导向配体采用具有介导内吞作用的配体，如碱性细胞生长因子、血管内皮细胞生长因子等。
5 基于抗体的靶向基因传递系统
为了获得DNA与特异性细胞的靶向结合，早期的研究是将不同的质粒DNA与各种单克隆抗体结合，在体内外转染小鼠淋巴细胞实验中，证明有一定的效果。Durrbach等用高度特异性的G250单克隆抗体与 DNA的结合物转染肾癌细胞也取得了较好的内化效果，还发现外源DNA从吞噬泡中逃逸是其转入细胞核所必需的。为了进一步提高DNA进入细胞核的能力，有报道在引入靶向抗体的同时，将质粒DNA与组蛋白H1非共价连接，其中组蛋白H1起到DNA载体的作用而降低核酸酶的降解，则有利于进人静止期细胞的细胞核；再把一种能使吞噬泡膜不稳定的膜去稳定性多肽（两性分子肽）连接上去，则有利于DNA从吞噬泡逃逸而进入细胞质。实验证明，这种新型基因载体不仅能在体外特异性地转染靶细胞，而且在体内经静脉注射后能在肾癌细胞中有效表达。
总之，非病毒载体转导的外源基因不会整合入宿主细胞的染色体中，不会使插入位点附近的基因过度表达或失活，也无插入突变的危险，因此，其安全性可能优于病毒载体。但非病毒载体的研究尚处于婴儿期，还存在靶向困难、转染效率低、有效表达时间短等问题。因此，还必须深入研究外源基因进入细胞的各种屏障及其细胞和分子机制。随着显像和标记技术的进展，这方面已进行了一些研究。细胞摄取是外源基因进入细胞的第一道屏障，虽然，有研究提示脂质体或脂质复合物可直接穿过细胞膜，但主要还是通过内吞作用进入细胞。虽然细胞表面与脂质复合物相互作用有关的生物分子尚未完全确定，然而细胞膜上的糖蛋白似乎起着重要作用。因为如果细胞膜上的糖蛋白合成缺陷，基因转移则更困难。基因转染的第二道屏障是质粒DNA从吞噬泡到胞质的转运。吞噬泡中的酸性环境及水解酶的存在可导致DNA的降解，而使转运效率降低。如果在载体系统中加入膜去稳定性多肽，如流感病毒血凝素N端寡肽、鼻病毒VP-1蛋白和pH敏感的两性多肽等可使转染效率提高10～1000倍。基因转染的第三道屏障是质粒DN A尚不能有效地转入细胞核，而且其转运机制还不清楚，到达细胞核的命运还知之甚少，但有研究提示DNA进入细胞核主要取决于DNA的大小，其次是其结构。线形DNA似乎比其它类型的DNA更有效地被转入细胞核中。如果在载体系统中连接上核定位信号多肽可显著提高转染效率。由于体内基因转移的机制随给药途径的不同而不同，比如：当静脉给予脂质复合物后，在其到达靶组织之前，其大小、结构和静电荷等物理特性将显著改变，其程度取决于与生物体液的相互作用。因此，还必须根据临床应用的实际来个性化设计基因转移的载体制剂。
可以相信，通过对非病毒基因载体基础和应用的深入研究以及各学科的共同努力下，将会使非病毒基因载体的基因治疗取得最大的疗效，同时最大限度地降低不良反应。
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