抗体芯片——新一代的蛋白分析手段

 
    蛋白质是一切生命活动的基础，受基因表达的调控，因而以检测样品中的mRNA为基础的cDNA芯片是当今研究中倍受关注的研究手段。但是，由于存在着转录后加工、翻译调控以及翻译后加工等多种调节机制，基因的表达，或者说mRNA的水平并不必然代表蛋白质产物的水平。因此，以微阵列技术对生物样品作整体蛋白质表达分析的蛋白芯片在后基因组时代越来越受重视。抗体芯片（Antibody Microarray，抗体微阵列），是蛋白质芯片的一种，是检测生物样品中蛋白表达模式的新方法。这种新技术使得研究人员可以在一次实验中比较生物样品中成百上千的蛋白质的相对丰度，将极大促进蛋白质组目前的研究状况——因为以现有的技术中对蛋白质进行这种复杂的分析是非常困难的。

    Clontech公司第一代的抗体芯片Ab Microarray 380（Cat.No.K1847-1）包含固定在玻璃片基上的378种已知蛋白质的单克隆抗体，可以在一次简单实验中同时检测样品中的378种蛋白质的表达情况，并且可以在一张芯片上对两种样品的表达模式进行比较分析。这使得抗体芯片在毒性实验、疾病研究和药物开发上有广泛的应用前景。Ab Microarray 380芯片上每个抗体都是并列双点以增加结果的可靠性，抗体针对广泛的胞内蛋白和膜结合蛋白，已知参与信号传导、癌症、细胞周期调控、细胞结构、凋亡和神经生物学等广泛的生物功能，因而可以用于检测某一特定的生理或病理过程相关蛋白的表达模式。尽管抗原来自人，但很多抗体可以识别小鼠或大鼠的样品。详细的资料可以上网查询。

    芯片上抗体的选择不但根据其特异性，也根据抗体的结合亲和力，在验证实验中特异性低、交叉反应高、或者信号强度低的抗体都被排除，另外所有抗体都经过检验保证得到的信号与抗原浓度有良好的线性相关，那些没有良好的线性剂量关系的抗体都被排除。因此抗体芯片能够检测到样品中很低的pg/ml浓度的抗原。

    第一代的蛋白芯片和DNA芯片一样是作为一种定性分析的工具，可用于分析样品之间相关蛋白的相对表达丰度；还可以作为DNA芯片的补充，用于研究蛋白和基因表达之间的关系。

操作流程
    抗体芯片并不要求特殊的技能，只要一般常规的操作就可以完成以往极为复杂耗时的工作。整个操作流程包括：从50—200mg组织或细胞、体液中进行蛋白质抽提——用Cy5和Cy3两种不同颜色的荧光分子分别标记两个样品——洗去多余的标记分子——与芯片杂交孵育——扫描分析结果。整个过程从样品制备到结果分析只要一天即可完成，你只要准备好样品、荧光染料、脱盐纯化柱（处理体液样品时用）和荧光扫描仪，其他的试剂全部由试剂盒提供。

优化的试剂
    随芯片试剂盒提供的蛋白抽提/标记缓冲液，是专门为抗体芯片而设计的，非常温和的去垢剂在能高效抽提膜结合蛋白（相比SDS煮沸法能抽提95%以上的蛋白）的同时能保持蛋白的天然活性（非变性条件），这样能够保证抽提的蛋白的溶解性和代表性，保证以后的实验结果的真实性，和原始材料的一致性。

Internally Normalized Ratio
    根据操作手册进行内源标准化处理可以得到一个内源标准化信噪比（INR），内源标准化处理是指对两个样品（A、B）中分别用两种荧光标记分子（Cy3和Cy5）标记，并交叉与芯片杂交（见图，A-Cy5和B-Cy3一组,A-Cy3和B-Cy5一组分别和芯片杂交），可以作为消除抗原—抗体结合效率差异的对照，也可以消除潜在的不同荧光分子的标记效率差异。假如Cy5标记效率高于Cy3，单纯一个实验的结果就会有偏差（Cy5标记的样品信号偏高），用这种双向交叉反应就可以消除这种偏差。两芯片杂交结果分别得到两组Ratio值，通过免费下载的工具就可以自动算出每个抗体抗原的INR值，这就代表在两个样品间某个蛋白的相对丰度。这种内源标准化处理可以大大减小样品分析的偏差。

    抗体芯片检测的结果不是蛋白的绝对含量而是378个目的蛋白在两个样品之间的相对丰度。值得注意的是由于抗体抗原结合的差异、标记差异等原因，根据芯片结果信号的强弱判断同一样品中两种不同蛋白的多少是不恰当的。

特点
* 整个分析过程可以在一天内完成
* 用荧光分析的方法比较两个样品之间378个蛋白质的相对丰度
* 适用于包括组织、细胞系、体液在内的多种生物样品
* 试剂盒提供完整的样品抽提制备、标记、孵育所需的Buffer，特别设计的样品制备的过程能保持样品的完整性和溶解性，保证制备样品具有代表性和一致性。
* 芯片上的抗体包含针对信号传导、癌症、细胞周期调控、细胞结构、凋亡和神经生物学等广泛的生物功能的相关蛋白，跨度大、适用范围广。
* 芯片上的抗体分别经过特异性抗原、细胞系和组织的检测，灵敏度高达pg/ml
* 开放性的芯片平台设计，可以用各种型号DNA芯片荧光扫描仪进行检测。