对癌基因与抗癌基因的评论
一、对癌基因与抗癌基因的评论
如果说癌基因是一个涵义混乱不确切的命名， 抗癌基因是同样的模糊不清。作者认为，所谓癌基因与抗癌基因都是一大类控制细胞 生长和分化的基因，对其单个基因来说，它的产物具有什么功能，因细胞种类甚至细 胞发育阶段而异。
1.癌基因与抗癌基因的相对意义同一种癌基因及其产物，在不同细胞中可起完全 相反的作用，最典型的例子是ras基因及其产物p21。在成纤维细胞中已有充分证据说 明，微量注入p21蛋白能使细胞迅速进入S期和开始分裂。人ras基因可使成纤维细胞 和某些上皮细胞恶变。但对点突变的嗜铬细胞瘤pc12细胞，将ras基因引入或微量注 射p21使恶性细胞停止分裂并开始分化。src基因对鸡成纤维细胞中的致癌作用是确定 无疑的，但在胚胎发育过程中，src基因的表达神经系统的分化密切相关，估计这样 的例子可能不尽是个别的。从生物学意义上来说，ras基因对成纤维细胞来说是癌基 因，对交感神经切来源的pc12来说是抗癌基因。同一基因的产物，是促进生长或抑制 生长，是抗癌还是致癌，似乎不取决于该基因的本身，而决定于细胞类别的差异。同 时提示不同细胞中以ras基因产物的效应系统不同，因此最后的生物学功能也不同。
2.促进和抑制生长物质的双重性 顾名思义，应将生长因子列入癌基因的范畴， 而生长抑制因子则应属抗癌基因之列。事实上，生长因子对不同细胞的作用差别很 大，除了受体的因素外，生长因子既可促进细胞生长，也可抑制细胞生长。同样，生 长抑制因子既可抑制细胞生长，也可促进细胞生长。因此，不区别细胞的种类即判断 哪些基因是促进或抑制生长，显然是不合理的。
3.肿瘤是一种异常生长 早在上一世纪，Virchow已提出肿瘤是一种异常生长的疾 病。癌细胞是一种以自主的，带有分化缺陷的持续生长的细胞。癌基因与抗癌基因的 研究，尤其是前者，从基因水平揭开了控制细胞生长和分化的物质基础，应该既不受 癌基因或抗癌基因的概念所束缚，同时也充分利用上述研究的大量材料，来揭示肿瘤 发生发展过程中，在生长和分化异常改变中的基因结构和功能改变。这不仅是对癌本 质认识的重要深化，同时也为控制癌细胞的异常生长提供新的线索。
二、对癌基因研究的战略及具体技术的评论
目前癌基因的研究，极需在概念和技术上有所突破。概念问题已如前述。现从战 略角度来讨论目前癌基因研究技术路线的得与失，并提出当前需要发展的技术路线及 其可行性问题。
（一）传统的研究技术路线
迄今为止，各实验室用于分离癌基因的技术路线大体上有以下几个方面：
1.癌细胞的基因组DNA，通过DNA转染后导入某些受体细胞。发生恶性转化后，组 建转化细胞株的基因文库，从中分离出癌基因的克隆。具体分以下几个环节：
（1）癌细胞的材料来源，文献报道，多数直接爰癌的体外细胞株作为材料，其优 点是材料易得而且单纯，易于提取到较完整的高分子DNA。缺点是体外培养过程中， 癌细胞的某些原癌基因可发生突变，新的原癌基因也可被激活，因此与体内原发性肿 瘤的癌基因谱不一定相同。所以，对某种特定的癌来说，材料来源奕以原发性肿瘤为 主，可以癌细胞株的研究提供相互验证。但原发性肿瘤的材料不均一，常伴有坏死， 提取高分子DNA有时会遇到一定困难，因此在提取DNA时应注意防止DNA的降解。
（2）高分子DNA的提取用于DNA转染的DNA，要求并不高。在转染前，还将用针筒吸 抽或其它机械方法将DNA分子撕裂至60kb左右，以利于导入细胞。由于这样的处理， 使用DNA转染技术获得的转化基因一般在50kb以下。这是DNA转染在技术上的限制。
（3）受体细胞的选择基因转移的常用的受体细胞为小鼠NIH3T3细胞，大鼠RAT-1细 胞，仓鼠CHEF细胞。上述细胞都属成纤维细胞。少数实验已开始用小鼠肾上皮细胞。 上述细胞中，NIH3T3对接受外源转化基因而发生恶性极为敏感，但自发生转化率高。 过去不少作者提出责难：NIH3T3细胞为一种“非整倍体”细胞，已属非正常细胞，所 以应用NIH3T3作为受体细胞大多获得的转化基因仍多属ras族。因此认为，为什么获 得上述结果，另有原因。这是由于DNA转染技术本身的局限性。
（4）DNA转染目前最常用的基因转移方法是DNA转染，即将DNA直接放入培液，通过 一定方式，使它进入受体细胞。DNA导入的技术有：
1）磷酸钙沉淀法这是利用pH7.01磷酸钙形成细颗粒， DNA吸附于颗粒而被导入细胞。其优点是方法简便、易 于重复。缺点是转移导入的效率低，均在10-6-10-7之 间。
2）电穿孔技术：这是利用高压电场，对细胞进行脉冲 式处理，使细胞表面通透性改变，有利于DNA分子进入 细胞。其效率一般比磷酸钙方法提高二个数量级或更 多。
3）抗药基因的共转染：由于DNA导入的效率很低（最 高仅10-3），因此如果共同导入抗药基因，可通过药 物去除大量未被转染的细胞，在具有抗药性的细胞中 选择出恶性转化细胞，而且会显著降低自发转化灶的 背景数。常用的抗药基因为pSV2-neo。用G418进行筛 选的缺点是G418价格昂贵。
（5）转化细胞的筛选经典的方法是通过G418筛选后，在转染后21在左右，收集转 化细胞灶，分别扩增。然后将转化细胞通过软琼脂生长，推测其生长能力。若获得细 胞集落，将其收集后，再度扩增。达到一定细胞数后，按106-107细胞．鼠接种裸 鼠，鉴定其在体内的成瘤能力。若获得阳性结果，从上述细胞株或裸鼠肿瘤中提取出 DNA，经Southern转移杂交，确定是否有人的DNA顺序整合入鼠类的基因组。探针一般 应用人的总DNA或Alu序列。若结果为阳性，说明获得了第一轮转化细胞株。必要时， 还需用上述转化细胞株的DNA，再次转染受体细胞，进行第二轮、第三轮DNA转染，以 纯化具有转化活性的人DNA序列。
最近二年来，G.VandeWoude及D.Blair的实验室，采用了简化的筛选方法：经药 物G418筛选后，将大量扩增的细胞直接种裸鼠，观察是否有肿瘤形成。这样可明显节 省时间和人力。
上述方法存在的共同问题是：在DNA转染后，细胞经药物筛选、扩增、裸鼠内生 长的不同阶段中，外源导入的DNA序列可发生突变和DNA重排。因此有可能会发现原癌 基因的重排或实变，即人为的激活。例如trk和mas这两个癌基因是在DNA转染中所发 生的两个基因片段的重排和拼接的结果。因此，对结果的分析必须极为谨慎。
（6）转化细胞株基因文库的建立基因文库的组建技术，可参考分子克隆技术的专 著（T.Maniatis等）。但在技术上提出几点，可供读者参考：
1）基因组DNA的部分酶切：按T.Maniatis的步骤，用不同酶量，先 小样后放大在量，很难重复，往往失败，浪费得之不易的DNA样品。 我们采用定量酶（一般以0.2U/μgDNA），酶切不同时间，从而选出 获得不完全酶切的最佳时间和条件，然后放大样进行反应，其优点 是重复性强。该方法已成为本实验室的常规方法。
2）载体的选择：目前最常用的是EMBL3或EMBL4噬菌体系统。其优点 是：可用双酶切（EcoRI及BamHI），使噬菌体载体难以重组，因此 不需对噬菌体双臂加以纯化；应用的受体菌为Spi-，大大降低了非 插入性噬菌体的背景。
3）应用上述载体系统，在包装后，可按1×105pfu/平皿的滴度用平 板进行扩增，获得>108-109pfu/ml的基因文库重组噬菌体（一般为 50ml以上）。这样的基因文库可储存一年以上，供上百次的筛选。
（7）基因的筛选及克性化若为未千的癌基因，可用人总DNA作为探针进行筛选；若 为已千的癌基因，则用相应的癌基因探针。选掼的噬菌体密度增加至105pfu/15cm直 径平皿。这样可前显增加筛选出阳性克隆的机率，经过三轮筛选，可期获得纯化的分 子克隆。
2.对已知的有染色体易位的癌基因进行分离：如慢性髓细胞白血病中有abl与bcr 的重排，形成ph1染色体。由于abl基因大于100kb，不可能通过DNA转染或从基因文库 中分暾出c-abl。因而，Baltimore实验室从cRNA文库中获得了全长的c-abl的cDNA。 从c-abl的cDNA同时可获得重排的bcr基因。但采用这种方法要有两个前提：一是这种 染色体易位要有代表性；二是其中一个癌基因是已知的。3.分析癌基因或原癌基因的 转录产物即mRNA；由于过量表达也是原癌基因被激活的一种形式，同时过量的表达产 物，即使没有突变，同样可导致细胞的恶性转化，如Ha-ras原癌基因在上游区安装强 的启动子后同样可以使NIH3T3细胞发生恶性转化，因此分析肿瘤的mRNA表达，也可提 供原癌基因被激活的证据。但是必须注意几点：
1)必须有相应的正常组织和癌旁的增生组织为对照。以肝癌为例，应以肝癌的周围 肝组织作为对照。
2)用β－actin或其它基因作为内对照，以排除mRNA制备过程中降解所造成的差 异。
3)用Northern转移和杂交的结果说明的是mRNA的水平，它代表转录水平、转录后加 工以及mRNA的代谢速度（半衰期长短）的总和，但并不等于转录水平的高低。
4)如果用细胞核和32P-UTP掺入，然后进行分子杂交，则反应了转录阶段mRNA延伸 的速度及数量，一般说来，可提示转录水平，但不等于最后成熟的mRNA水平。因此， 在解释以上3)、4)两个方面的实验结果时，必须注意其实际的内容。
（二）新的战略的探索
由于以上传统技术路线的局限性，目前极需考虑采用新的战略技术。
1.应用癌细胞的cDNA基因文库进行DNA转染由于在转染过程中应用的基因组，能进 入细胞并完整地整合于受体细胞基因组的外源DNA片段，一般仅在50kb以下，因此应 考虑采用cDNA文库作为转染的DNA来源。但存在问题是，必须获得所谓全长cDNA文 库。在技术上来讲这是有相当难度的，同时，cDNA整合后，能否持久表达，也还在不 少未知因素，但是，这仍是值得设法采用的技术。
2.应用细胞融合来代替DNA转染存在问题是该技术只能限于人癌细胞和异种细胞（NIH3T3 或RAT-1）的融合。若用人－人细胞杂交，对外源的基因难以选择。
3.应用人体细胞作为受体细胞这更接近于人体肿瘤癌变模型，但存在的问题是：
（1）只适用物已知的癌基因，并需带有质粒载体，后者可用来作为选择的标记。
（2）用人癌细胞或其DNA来转染，由于缺乏选择的标记，无法辨认外源的基因。
（3）人体细胞对一般已知的癌基因如ras、myc均具有抗性，即不出现恶性的表 型。
但是人体细胞的恶性转化研究，适用于研究某些病毒及癌基因的相加作用。尤其 是，如果某些病毒可使人体细胞发生持续分裂与增殖，而阻断其老化或终未分化，癌 基因将会使细胞发生恶性转化。因此用病毒处理后的人体细胞作为受体细胞将是一条 值得探索的新途径。
