第十八节：癌基因与抑癌基因——癌基因概述

癌基因概述

　　癌基因显性作用与抗癌基因的失活是肿瘤发生的分子基础，现认为，肿瘤是多种 癌基因多阶段途径协同作用的结果.癌基因(oncogene)是指细胞内或病毒内存在的，能 诱导正常细胞发生转化，使正常细胞获得一个或多个新生物特性的基因，1968年 Duesberg等首次发现Rous肉瘤病毒基因组中有一种编码酚氨酸蛋白激酶的基因并证实 它在细胞转化中起关键作用，因这种基因来自病毒，因而被命名为病毒癌基因(Virus oncogene V-onc).1972年Bishop应用核酸分子杂交法证实，几乎在所有高等脊椎动物细 胞的基因组中，都拥有和病毒癌基因相似的DNA核苷酸序列，因这DNA所代表的基 因是动物细胞基因组的成员之一，就称为细胞癌基因(cellular oncogene，C-onc).在人体 正常细胞中存在一种称为原癌基因(Proto-onc)的正常基因，它在细胞中起着调控细胞 生长和分化的作用，这类基因广泛存在于生物界中，从酵母到人的细胞中都存在着原 癌基因，

　　在进化过程中这类基因是高度保守，属于看家基因(house-keeping genes)，按照原 癌基因的结构，产物的功能及所在位置.将己知的细胞癌基因分为下列四类:1，蛋白激 酶类;2.信息传递蛋白类;3.生长因子及其受体类;4.核内蛋白类.细胞癌基因普遍存在于 各种细胞，在正常情况下的表达或有时间，空间限制的表达，参予细胞分化及增殖， 癌基因在生物进化中大都表现为高度保守性，正常细胞中的癌基因和肿瘤细胞中的癌 基因的核苷酸顺序十分相似，后者可使NIH3T3细胞恶性转化，前者离经激活后才具 有转化能力，说明在正常情况下细胞癌基因不致癌，生理条件下内外环境中的某些刺 激可激活癌基因，从而调节细胞的生长，分化和信息传递，因此通常认为，癌基因并 不是肿瘤所特有，而是细胞的生长，分化和信息传递.而是细胞的正常基因，只有在 异常表达或发生突变时，才会导致肿瘤发生.细胞癌基因的生理功能主要表现为两方面 :一是调节细胞生长，另一是参予细胞分化和发育过程.虽然细胞癌基因的表达产物和 表达方式不同，但具有作用相关性，它们在时间、空间上协同作用，能维持并协调细 胞的正常增殖与生长发育.具有正常生理功能同时又具有潜在致癌能力的原癌基因， 其致癌潜能的发挥，通常需要首先被激活，常见的激活因素，有病毒、化学物质、辐 射等.激活的机制可分为两大类:一类是由病毒诱导的活化，如反转录病毒感染、动物 细胞后，得到一个动物细胞的原癌基因顺序，并把它整合进自己的基因组内，这一原 癌基因便被激活，或者反转录病毒感染动物细胞后，将它本身基因组内的一个强大增 强子或启动子插入到动物细胞原癌基因的附近或内部，使原癌基因激活;另一类是非 病毒诱导的活化，如点突变基因扩增和染色体重排.

　　在恶性肿瘤发病过程中，除了癌基因起作用外还涉及到另一类基因.即肿瘤抑制 基因(tumorsuppressorgene)或抗癌基因.这是一种抑制细胞生长和肿瘤形成的基因.在生物 体内与癌基因功能相抵抗，共同保持生物体内正负信号、相互作用的相对稳定.肿瘤 抑制基因的失活和癌基因的激活都是癌化过程的一部分.抗癌基因主要有以下功能:(1) 诱导终末分化.(2)维持基因稳定.(3)触发衰老，诱导细胞程序性死亡.(4)调节细胞生长. (5)抑制蛋白酶活性.(6)改变DNA甲基化酶活性.(7)调节组织蛋白酶活性.(8)调节血管形 成.(9)促进细胞间联系.癌基因受内外多种因子等的激活，使细胞生长分化失控，增强 了细胞瘤性转化的可能性，当抗癌基因失活时，进一步加剧了细胞瘤性转化，最终导 终了细胞癌变的发生.恶性肿瘤转移是肿瘤患者死亡主要原因，它涉及到肿瘤细胞自 与宿主之间错综复杂的关系，目前认为，肿瘤细胞转移基因的激活和转移抑制基因失 活可诱发肿瘤细胞转移表型而导致转移的发生，原发部位肿瘤组织中具有转移潜性的 细胞群是肿瘤转移的细胞生物学基础.

　　到目前为止，发现的癌基因己有100多个，抗癌基因有7个，转移基因及转移抑制 基因各有一些，癌基因的发现和深入研究，提高了人们对恶性肿瘤的发生，发展规律 及对细胞增殖.与分化的调控机制及其浸润转移机制的认识.肿瘤的发生与转移与某些 特定的癌基因密切相关，对这些癌基因及其产物的检测，为肿瘤的临床诊断提供了一 条崭新的途径，必将受到临床实验室技术人员和肿瘤工作者的重视.

肿瘤基因及其产物的分类

　　随着对肿瘤基因产物的逐步了解，目前肿瘤基因按其产物的功能和分布大体上可分为以下五类：

肿瘤基因、细胞及病毒性肿瘤基因

癌基因及其产物的检测方法

　　检测癌基因及其产物的标本可以是实体瘤和体液，前者需要提取DNA或RNA进行检 测，或经过组织切片以免疫组化方法检测基因表达产物，或者采用血尿标本，用 ELISA等法检测癌基因蛋白，几种主要检测方法介绍如下.

(一)Southern杂交法

　　该法系提取实体瘤标本中的DNA，经过酶切，电泳再转印到硝酸纤维膜上，以特 定的癌基因探针进行检测，该法十分特异，但比较复杂，而且采用³²P标记，在临床 实验室不易推广.采用自动化程序分析Southern印迹，并用非放射性物质标记，有可 能使这种方法在癌基因诊断中常规化.

(二)原位杂交

　　将组织，细胞固定在玻片或硝纤膜上，经适当处理后，与相应探针杂交，可确定 与探针互补序列在细胞内的定位或确定含特异癌基因的组织培养细胞，或者细胞在组 织培养碟内生长至70%融合时，将硝纤膜放在细胞单层上，轻轻加压，使滤膜表面与 细胞层完全接触，细胞被转印至硝纤膜上，室温干燥后，烘干，预杂交，再与³²P-dCT P标记探针杂交，最后用X光自显影或β显微镜检测，可以在待检细胞中显示癌基因的 存在.

(三)酶联免疫吸附试验

　　检测癌基因蛋白可采用酶联免疫吸附(ELISA)法，如在检测myc蛋白时，先用总 myc抗体包被，细胞裂解物中捕捉c-myc，N-myc和L-myc蛋白，最后加入结合碱性磷化 酶的抗-myc抗体，以AMPAK系统显示结果，即碱性磷酸酶通过脱磷酸作用使NADP变成 NAD，再通过氧化还原反应使无色体DNA-Violet还原为有色的甲潜，比色测定结果， 此法检测P62c-myc的灵敏度可达3pg，EDSA法显效，特异，简便，只有有相应基因蛋 白的抗体，就可以检测，因而在癌基因蛋白检测中广为应用.

(四)免疫组化染色

　　这种方法是检测癌基因蛋白较常用的方法.如检测c-erbB-2基因，常规制备组织 切片，加入稀释的抗体，再加上亲和素生物素-过氧化物酶复合物，底物显色，抗 c-erbB-2，证明C-erbB-2蛋白定位在细胞膜上，免疫组化技术是目前对癌基因蛋白进 行细胞定位的优选方法.

(五)PCR技术

　　PCR技术是一门新型快速诊断技术，它利用热稳定的DNA合成酶-Taq多聚酶，在体 外合成特异的DNA片段，两条寡核苷酸引物结合在待扩增DNA的两侧，通过反复循环的 DNA变性，引物退火和延伸，短时间内可使目的DNA得到大量扩增，这种方法可以检测 癌基因的最有效方法，尤其是癌基因在结构上微小改变如重排，缺失，扩增，突变等 都能快速诊断，癌基因表达水平的高低同样能用定量PCR快速诊断，尤其运用PCR定点 突变技术可以改变物种的遗传性状，在肿瘤的基因治疗方面获的广泛应用，总之，随 着分子生物学的发展，PCR及其相关技术已经渗透到各个研究领域，并成为遗传学， 生物学，肿瘤学等研究的崭新手段，更为可喜的是，PCR技术不仅仅在基础研究中获 得广泛应用，而且在临床诊断和疗效评估方面获得越来越广泛的应用，给医学带来了 一场深远革命.

(六)PCR相关技术

　　PCR飞速发展和广泛应用于科学研究和临床医学实践中，在不同领域里发挥了巨 大的作用，促进了生物学研究很多不同领域的发展，但由于检测目的的不同，实际应 用中的方法也有差异.基于对PCR基本原理的认识和基本技术的掌握，相应地派生出了 许多的新的相关技术和改良方法，如:PCR-RFLP法，PCR-DNA测序法，以及可用于原位 检测微量DNA的原位PCR法，这些方法极在地便利了鉴定和分析真核DNA的突变和检测 所欲测目的基因的变化，从而成为PCR技术的有益和实用性的延伸和补充.

　　1.PCR-RFLP技术:PCR-RFLP全称多聚酶链反应(PCR)一限制性片段长度多态性 (restriction fragment length Polymorphism，RFLP)分析.PCR-RFLP主要有三个环 节:(1)靶基因PCR扩增;(2)扩增的DNA片段限制性酶切图谱(长度多态性).该术应用PCR 将目的基因片段扩增百万倍以上，即使被测样品核酸量小于pg水平，也能被扩增出 来，这不仅大大提高了基因分析的灵敏度，而且无需标记或放射性探针杂交过程.PCR -RFLP主要用于核酸变异性分析与比较，当DNA或RNA分子由于单碱基突变或序列重 排，使某种酶切位点增加，减少或消失，导致限制性酶切片段长度发生改变，就产生 了限制性片段长度多态性，由于限制性内切酶在DNA分子上有特异的酶切位点，根据 其识别序列的位置和数量，可以把大小相似而序列有差异DNA切割成不同的片段通过 核酸电泳，可将长度不等的DNA片分离而显出其长度多态性(片段的大小).

　　PCR-RFLP用于基因分析具有分辩率高，重复性好，简便快速直观等优点，主要用 于微生物的分群分型分亚型，癌基因分析，遗传病的诊断，HLA分型及载脂蛋白基因 的分析等.

　　2、PCR-SSCP技术:PCR-SSCP是聚合酶链反应一单链构象多态性分(single strand conformation polymorphism)的简称，原理是将经扩增的DNA片段经过变性处 理，形成单链，由于序列不同，单链构象就有差异在中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳的迁 移率不同，通过与标准物的对比，即可检测出有无突变.SSCP技术自创立以来，经历 了自身的发展完善过程，刚建立时是将同位素掺入PCR扩增的产物中，通过放射自置 影来显示结果这给技术推广造成一定困难，随后有人把DNA的银染方法与PCR-SSCP结 合起来，用银染取代同位素显示DNA带型，大大降低了成本，具有经济、快速、灵敏 等特点.1993年起用EB染色法显示DNA带型，使得SSCP操作更简单，更经济，更迅速， 目前这种方法己大量应用.

　　PCR-SSCP分析法是一种检测基因变异的方法，具有操作简便、快速、不需特殊设 备，适用于大样本筛选的特征.经己广泛应用于检测各种病原体基因的点突变及缺失 突变，基因的多态性分析等.

　　3.PCR-southern blot: 或Dot blot技术是将PCR扩增产物转移到硝酸纤维膜或尼 龙膜上，再与标记的特异性探针进行杂交，然后放射自显影，来检测有无特定的扩增 片段及相对含量，此种方法，可以直接检测基因的点突变，缺失及重排，比PCR产物 EB染色电泳分离法的灵敏度至少要高103以上，由于非放射性同位素标记的探针的应 用，使得PCR-southern blot应用更简便，现己广泛应用于癌基因:遗传特异基因，病 原体特异基因等方面的研究及检测.PCR-Dot blot即将PCR扩增产物变性后直接点在膜 上，与标记的特异性探针进行杂交，它来时短，可用半定量分析，一张膜上可同时检 测多个样品，缺点是只能看到一个斑点，必须小心控制反应条件，设立阳性及阴性对 照，以便对待检测标本做出正确鉴定.

　　4.不对称PCR直接测序法:扩增产物的测序，可以很容易确定群体中某一特定基因 的序列变异情况，这种方法是了解目的基因突变的最理想方法，在扩增反应中加入不 等量的两段寡核苷酸引物，通过PCR扩增获得单链DNA，然后利用双脱氧法直接测序， 便可知道有无突变.

　　5.原位PCR技术:原位PCR，即聚合酶原位扩增技术，是将PCR技术与原位杂交技术 结合起来，不改变与周围组织的原有位置关系，直接在组织、细胞或病原体原位研究 基因变化的技术.这种技术既提高了杂交的灵敏度，又能直接置微观察病变部位，而 且标本不需特殊处理或制备，不需标记探针，比较省时和经济，尤其对形态学研究具 有其它方法难以比拟的独倒长处，原位PCR自创立以来，已经在神经性疾病，肿瘤中 微生物病原体等多种检测中得到广泛应用.

肿瘤基因与抗癌基因错误的命名和概念

　　原有的概念认为肿瘤基因是细胞内一类与恶性变有关的基因族，它的前身为原癌基因。当原癌基因为某些因子所“激活”时称为肿瘤基因。正常情况下，原癌基因与细胞生长有关。与此同时，认为细胞内存在一类与肿瘤基因功能相对抗的基因族，即抗癌基因（anti-oncogenes）或阻抑基因（suppressor genes），其功能抑制细胞生长或促进细胞分化。肿瘤基因的少许激活同时伴有阻抑基因的失活引起细胞生长的失控而导致细胞恶性变。这种观点已成为当前最为流行的概念。但是，近五年多来的大量资料表明，肿瘤基因的含意颇为含糊，甚至是错误的。随之，抗癌基因的概念也是不确切的，理由是：

　　1.所谓肿瘤基因或原癌基因是一大类控制细胞生长、分化的基因族，在百亿年前早已存在，从单细胞生物酵母一直到人普遍存在，而且其结构高度保守。然而，恶性肿瘤是演化晚期（尤其是脊椎动物）生物获得的一种疾病。从演化过程来看，肿瘤基因的出现远远早于肿瘤的发生。

　　2.在正常生物体中，原癌基因并不是静止和不表达的基因，相反，它经常是处于“激活”状态，其转录是活跃的，这些产物与细胞的生长和分化密切有关，关键在于这类基因的“激活”是受到严格的时间（细胞发育阶段、细胞周期析某一阶段）、空间（组织和细胞类型）、次序（表达的前后程序）方面的控制。正因为这些原癌基因的活动，受精卵才能分裂，胚胎才能发育，如myc，myb对造血系统细胞的分化，src及ras对神经系统细胞的生长和分化等，组织受损伤后才能再生和修补（例如sis基因产物血小板生长因子PDGF），从而生物体才能生存。

　　3.肿瘤基因与逆转录致瘤病毒的关系：逆转录病毒的出现，以及它们感染细胞后的转导（transduction）过程中，摄取机体基因组中某些基因片段，这是一个普通的生物学现象。仅仅是偶然的机会，当逆转录病毒摄取了某些与生长密切有关的基因即原癌基因，进行了加工，包括去除内含子、修饰或改变其5'及3'端的结构，使这些片段具有了致癌的活性，（即v-onc）才使携带这些v-onc的逆转录病毒成为急性转化病毒。这种现象从总体来说，应该说是一种偶然现象。如果估计原癌基因（包括生长因子、受体的基因）有400-500个，v-onc及其相应病毒还不到其20％。因此，不能因为逆转录肿瘤病毒与部分原癌基因有关，就认为原癌基因都是潜在的致癌基因。

　　4.部分原癌基因确实与恶性变有关。但这仅仅在外界致癌因子（化学、病毒、放射线）作用下使原癌基因发生了编码区的突变，调节区的改变、基因放大等，发生了所谓的“激活”，使它们的表达在基因产物的量或质发生了改变，尤其是它们的表达不再接受原有调节系统（cis或trans）对它们在时相（细胞周期、发育阶段）、空间（细胞类型）的控制而产生了异常的、体质性（constitutive）的表达，这才会异致细胞的异常生长和恶性变。这种“激活”并不是分子生物学中所指的基因转录状态的激活，而是一种异常的激活。因此当前在癌基因中所用的“激活”－词也是不恰当的命名。

　　5.当前普遍认为原癌基因的产物与细胞生长有关。已证明rad基因在成纤维细胞、上皮细胞可促进细胞生长甚至恶性转化，但对某些神经细胞起着抑制生长的促进分化的作用，因此，原瘤基因或肿瘤基因的功能－促进生长还是促进分化，依细胞的种类而差异。即使像ras基因那样，也不能认为只有促进生长和致癌的作用。

　　6.肿瘤基因或原癌基因的命名很不确切，与它相对应的，抗癌基因的含义同样存在含糊和混乱。目前抗癌基因的含义还不清楚，它可能是编码抑制生长、促进分化的基因，也可能是某些基因的负控制调节基因，并是维持基因组织定性的某些基因。而且，不少抑制细胞生长的因子（GIF），因细胞种类不同，可有促进细胞生长的作用，因此其涵意和命名也同样有待进一步澄清。