植物抗病基因工程的研究进展及前景展望

生物谷

        引言

        植物病害给人类带来严重的危害，因而人类与植物病害的斗争贯穿于农业的发展与进步之中。兴起于20世纪初期的经典遗传学使人们能够通过杂交育种成功地培育出新抗病品种，大幅度地提高粮食产量。近年来，分子生物学理论和技术的不断发展完善，使人们不但能够从分子水平上进一步研究植物与病原菌的相互作用机制，而且还可以通过基因工程这一现代生物技术直接、快速和高效地培育抗病作物品种。

        1　植物抗病基因工程的原理

　　植物抗病基因工程指的是用基因工程(遗传转化)的手段提高植物的抗病能力，获得转基因植物的方法。植物抗病基因工程主要包括以下内容：抗病及其他相关基因的分离和克隆；与合适的载体及标记基因构成适于转化的重组质粒；用不同的转化方法向受体植物导人重组质粒；筛选转化子并鉴定转基因植株。此外，还有一种可以获得抗病转基因植物的方法是将具有抗病能力的植物或微生物的  DNA  直接导入受体植物，从后代中筛选具有抗病能力的个体，经过稳定得到转基因抗病植株。

        2  利用基因沉默技术培育抗病作物

　　据美国加利福尼亚大学戴维斯分校  (UC  Davis)  的科学家宣称，利用“基因沉默”技术，可以培育抗细菌病害的作物品种，使很多种多年生果树和坚果树包括核桃、苹果和葡萄等，免于催患细菌性根癌病。UC  Davis  果树学系的科学家  Abhaya  Dankekar  和  Matthew  EsCovbar  发现，“基因沉默技术可用于抑制细菌性根癌病时的肿瘤形成”。果树基因工程权威  Dandeka  ：教授说：“基因沉默是当前植物科学中最吸引人的技术之一。”细菌性根癌病是由常见的土壤细菌根癌土壤杆菌(根癌农杆菌)  (Agrobacterium  tume  faciens)  引起的。这种细菌具有通过水平基因转移过程，将其自身的  DNA  转移于其所感染的植物的  DNA  的独特能力。通过这种特殊的寄生方式，根癌土壤杆菌可使受感染的植物形成根癌。科学家们用番茄和拟南芥为实验材料。通过中断或抑制目标基因的活性，达到“基因沉默”。选定的目标是两种可导致植物生长激素过度产生的细菌基因，因为植物生长激素的过度产生，可导致细胞无控制地增殖和根癌形成。

　　利用“基因沉默”技术育成的基因工程植物，虽可被根癌土壤杆菌感染，但不会产生导致根癌形成的激素。已证明，与对照比较，基因工程番茄和拟南芥植株中根癌的形成减少了90％以上。但这些基因工程植物，除了不会产生根癌外，其他方面与其非转基因对照完全相同。“基因沉默”技术可用于利用砧木进行嫁接的果树。

        3　用于植物抗病基因工程的目的基因

        3.1　植物抗病基因

　　狭义上的抗病基因  R(resistance  gene)  是指寄主体内能特异性识别病原并激发抗病反应的基因，它与病原菌的无毒基因  Avr  (avirulence  gene)  互补。编码胞外和胞内两种类型的受体蛋白，是抗病反应信号转导链的起始组份，当与病原菌的无毒基因直接或间接编码产物(配体)互补结合后，启动并传导信号，激发如过敏反应  HR  (hypersensitive  osponse)  和系统获得抗性  SAR  (System  acquired  resistance)  的抗病反应。由于  R  基因是一类诱导表达的不知产物和性质的基因，传统的基因分离方法不再适合。因此分离  R  基因一直是个难题。第一个植物  R  基因  Hml  是1992年  Johal  等用转座子标签法  (transposon  tagging)  克隆到的。近年来随着图位克隆  (positional  cloning)  等方法在  R  基因分离上的成功应用，已先后分离出近20个抗病基因。

        3.2　病原体无毒基因

    　目前无毒基因在植物抗病基因工程上的实际应用远比植物本身的抗病基因广，且有良好的应用前景，因此对无毒基因的克隆具有重要的意义。克隆无毒基因主要有：(1)基因库互补法。通过细菌交配实验，将一个病原菌小种基因文库的克隆互补到另一个小种菌株中，从而使后者的寄主特异性发生改变而进行克隆；(2)产物导向法。根据无毒基因编码的产物性质，先分离无毒基因的转录产物合成寡核苷酸探针，然后从病原菌基因组文库或  cDNA  文库中筛选无毒基因克隆。Avr4  和  Avr9  便是用此方法克隆到的；(3)转座子标签法。与  R  基因转座子标签法克隆方法类似，只是所用的是原核生物转座子如Tn5。

        3.3　植物防卫反应基因

　　植物的防卫机制极其复杂，包括水解酶和病程相关蛋白  (PR蛋白)  的产生、植物保卫素的合成和积累、细胞壁的木质化作用以及富含轻脯氨酸糖蛋白在细胞壁的积累等许多方面。这里主要介绍植物产生的水解酶和PR蛋白。

        3.3.1　几丁质酶基因和葡聚糖酶基因  几丁质酶  chitinase  和葡聚糖酶在正常情况下只在植物体内有低水平的组成型表达。但病原菌侵染、诱导物处理及各种伤害可诱导产生高水平的  chitinase  和葡聚糖酶。这两种酶的作用底物在植物中不存在，但存在于大多数真菌的细胞壁中。纯化的几丁质酶和葡聚糖酶单独或同时存在，都能抑制病原真菌的生长。自1986年  schlumbaum  等首次报道提纯的菜豆几丁质酶具有抗真菌活性以来，已经相继从菜豆、水稻、烟草、油菜、马铃薯、小麦、玉米和甜菜等多种植物中克隆到了几丁质酶基因，对立枯丝菌等20多种真菌表现出体外抑菌活性。一些葡聚糖酶基因也从大豆、大麦、烟草等作物中分离，与合适的启动子构建重组质粒后转化植物获得了转基因植物。

        3.3.2　溶菌酶基因  溶菌酶具有几丁质酶和葡聚糖酶的双重活性，对植物病原菌表现出很强的裂解活性。在已获得的  T4  噬菌体溶菌酶基因的转基因马铃薯中，虽然只有低水平的合成表达，但能有效地分泌到胞间隙中，明显提高对马铃薯黑胫病的抗性。

        3.3.3　抗菌蛋白基因

        抗菌蛋白基因具杀死病原细菌的活性。从某些植物、昆虫、微生物中均分离到抗菌蛋白，也有报道成功地克隆了美洲商陆的抗菌蛋白基因，但还没有获得转抗病蛋白基因的转基因抗病植株。不过，用人工合成的裂解肤基因转化烟草，获得的转基因烟草对青枯病菌感染表现出抗性。

        3.4　降解或抑制病原物致病因子的基因

　　在病原菌侵染致病过程中，病原菌产生的细胞壁降解酶和致病毒素起重要作用。例如，多聚半乳糖酸酶  (polygalacturonase  PG)  是一种细胞壁降解酶，在一些双子叶植物中发现有多聚半乳糖酸酶抑制蛋白  (PGIPS)，PGIPS  能有效地抑制植物病原菌的  PG  活性，提高植物的抗病能力。菜豆和梨的  PGIPs  基因已被分离克隆，正在进行转基因研究。

        致病毒素是重要的致病因子，如果植物能降解病原菌在侵染过程中产生的毒素，那么植物就可以有效地对抗病原菌的进一步侵染，从而提高抗病的能力。病原菌具有自我保护作用的毒素降解酶系，从病原菌中分离克隆毒素降解基因并导入植物，就能提高植物的抗病性。

　　尖抱镰刀菌使许多植物患枯萎病，该菌产生的镰刀菌酸毒素在致病过程中起重要作用，已从  leebiella  oxytoca  HY-1  菌株中分离到了能降解镰刀菌酸的基因，并得到转基因番茄，其对  F.oxysporum  的抗性研究在进行中。而  Moffat  报道已经克隆了编码降解镰刀菌酸的基因，转基因植株对玉米枯萎病表现出抗性。

        4　转化方法

　　1983年第一例转基因植物获得成功以来，国内外科学家设计发明了多种转化方法用于植物基因工程。其中，农杆菌介导的基因转移占绝大多数，在成功的例子中占80％。基因枪法也是主要的转化方法，其他的转化方法也都成功地得到了转基因植株，各具特点。

        4.1农杆菌介导法

　　第一例转基因植物就是用农杆菌介导法完成的。根癌农杆菌和发根农杆菌属革兰氏阴性菌，对双子叶植物侵染广泛，在某些条件下对单子叶植物也有一定的感染性。根癌农杆菌含有  Ti  质粒，Ti  质粒上的  T-DNA  可以插入到植物基因组中，诱导在宿主植物中瘤状物的形成。因此，将外源目的基因插入到  T-DNA  中，借助  Ti  质粒的载体作用，使目的基因在宿主植物中整合、表达。农杆菌介导法又可根据其受体材料不同分为原生质体共培养法、叶盘法和创伤植物感染法，其中叶盘法在许多植物上得到广泛应用。汤浩茹等通过农杆菌介导法将哈兹木霉几丁质酶基因导入核桃。有人将含  TI  基因和抗菌肤  B，D  基因的双抗载体以及抗黄瓜花叶病毒的基因转入西瓜，得到了。Kan  抗性植株，但未发现含  TI  和抗菌肤  B，D  基因或者是抗病毒的转化后代。

        4.2　基因枪法

    　又称微弹法、粒子轰击法等，是利用放电加速的金属粒子携带外源  DNA  打入植物细胞或组织中进行基因转移的一种方法，1987年由美国康奈尔大学的  J.c.sanford  发明。基因枪法的操作对象可以是完整的细胞或组织，突破了基因转移的物种界限，也不必制备原生质体，实验步骤比较简单易行，具有相当广泛的应用范围。

        4.3　其他方法

　　离子束介导法，利用离子束对细胞壁的溅射和刻蚀作用，在细胞表面形成许多微孔道，为外源基因进入细胞提供了路径。倪大虎  等用该法将将抗菌肤  shiva  基因导入到水稻恢复系的成熟胚中，经愈伤诱导和绿苗再生，PCR  检测分析证明外源基因已整合到再生植株的基因组中。吴丽芳  等将水稻几丁质酶基因  RcHS  用离子束介导法转入三个小麦品种中，分别得到了转基因植株，经分子检测证实了  RcH8  基因的整合，再生植株的叶片提取物表现出对小麦赤霉病的抑制作用。脂质体法，用人工合成的、类似生物膜结构功能特性的脂类化学物质(脂质体)，将  DNA  包裹成球体，通过植物原生质体的吞噬或融合作用把  DNA  转入受体细胞。激光微束法，利用激光微束精确的定向性和损伤小的特点，将激光聚焦成微米级的微束去照射细胞，在细胞膜上可形成能自我愈合的微孔，使外源  DNA  易进入细胞实现基因的转移。超声波法，利用低声强脉冲超声波的物理作用，击穿细胞膜造成通道，使外源  DNA  进入细胞。

        5　植物抗病基因工程的前景展望

　　植物基因工程是细胞水平和分子水平上的遗传操作，其最大优点是能最大限度地利用人们所感兴趣地外源基因以及使工作更具目的性，给植物抗病育种提供了一条十分有效和有用的途径。在抗病育种方面，科学家可以通过基因工程技术将抗病毒、抗细菌和抗真菌的基因引入植物中，从而提高植物的抗病性。而且，用转基因的方法比常规的杂交育种方法，在育种周期上要缩短3～4年，展示了植物抗病基因工程在育种上的应用前景。

　　然而植物基因工程本身存在很多问题：外源基因能否稳定高效地表达转基因植物本身的优良性状是否受到影响而且目前可用于转化的抗性基因太少，转移的基因存在基因沉默的现象，都限制了植物抗病基因工程的发展。

　　因此植物抗病基因工程要获得深入发展，加强相应的基础研究是十分重要的。比如对植物个体遗传发育规律的研究；对植物体内基因表达调控的研究；对植物与病原物之间的特异性作用及其机理研究；对抗性基因的筛选、克隆研究等等。在上述研究的基础上，将合适的抗性基因进行巧妙的加工，通过合适的转化方法，按预定位置插入植物基因组中，并使之在一定的时间和器官中稳定表达，就可以获得大量的抗病转基因植物品种。可以预见，用转基因方法选育抗病植物品种将成为农作物抗病育种中最有效、最常用的手段。

        注：

        （1）参考文献：略；需者可与本站Email联系，或到中国水稻研究所图书馆查阅；

        （2）文章来源：生物技术通报，2005年　第5期；

        （3）作者单位：北京林业大学生物科学与技术学院。