台湾虫草及其无性型关系的分子确证
2 结果与分析
2.1 DNA纯度的检测
从台湾虫草子座和菌丝体中提取的DNA溶于50?L的ddH2O中，取5?L用琼脂糖凝胶电泳检测，电泳发现其DNA为一条明显亮带，证明其纯度较高，可进一步进行PCR扩增。
2.2 PCR扩增产物的电泳检测
运用PCR技术从台湾虫草子座及其无性型黄山被毛孢的DNA中特异扩增了rDNA的ITS序列，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，为一清晰条带，无其它杂带，分子量估计为600bp左右。
2.3 ITS序列的分析
根据测序结果，得到台湾虫草子座和黄山被毛孢的全部ITS区（ITS1 + 5.8S + ITS2）的序列，GenBank登录号分别为EF689044和EF689043，两者的序列完全一致，整个ITS区共计478bp，其中ITS1为139bp，5.8S为178bp，ITS2为159bp，显然是属于同一生物种的不同生长阶段，前者为其有性型，后者则为其无性型。从而从分子水平上证明分离得到的菌株（黄山被毛孢）确为台湾虫草的无性型。
测得的台湾虫草的序列与GenBank数据库比对发现，和台湾虫草相似率较高的序列大部分都是登陆的冬虫夏草C. sinensis及其无性型中国被毛孢H. sinensis的序列。台湾虫草和C. sinensis（登录号：AJ488270）及H. sinensis（登录号：AJ309356）的相似率分别为83%和81%。台湾虫草和H. rhossiliensis（EF546655）、H. thompsonii（AF293844）、H. kirchneri（EF194154）、C. multiaxialis（AJ309359）、C. heteropoda（AB084157）、C. heteropoda（AB027373）的相似率分别为80%、80%、82%、81%、80%和85%，其中C. multiaxialis已证实其为冬虫夏草的同物异名（蒋毅和姚一建 2004），根足虫草C. heteropoda变种的无性型为Hirsutella heteropada（Li et al. 2006）。
为了进一步比较台湾虫草及其无性型与被毛孢属其它种的关系，以柱形虫草C. cylindrica做外群，台湾虫草与其在GenBank数据库比对得到的一些被毛孢属的其它种构建了系统进化树（见图1）。
图1 被毛孢属的ITS1-5.8S-ITS2rDNA区域分支系统树
Fig. 1 Neighbour-joining tree based on ITS1-5.8S-ITS2 region sequence data from Hirsutella spp.
从系统进化树可以看出，台湾虫草和黄山被毛孢在一个分支上，且支持率为100%，系统发育树可分为两个主要分支，一支由C. sinensis、H. sinensis、C. cochlidiicola、C. heteropoda和H. rhossiliensis构成，另一支由C. formosana、H. huangshanensis和C. heteropoda构成。可见台湾虫草和黄山被毛孢是同一物种生长的不同阶段，即黄山被毛孢为台湾虫草的无性型，台湾虫草的无性型归为被毛孢属较为合理。
3 讨论
关于虫草无性型的分离与确证，经典方法主要有：（1）虫草子囊孢子微循环产孢，该方法简单可靠，但一些子囊孢子难以诱导进行微循环产孢。（2）多途径多批次统计分析法确证，但此法费时耗力，常常难以采集到多批次相同的虫草。（3）人工诱发子实体，依照Koch的理论，最可靠的方法就是把无性型接种到有性型的寄主上培养出子实体，但由于很多虫草的天然生长条件很难模拟，所以培养出子实体相当困难。
随着分子生物学的不断发展，DNA测序技术已成为研究系统发育最为有效和可靠的方法之一，在鉴定虫草有性型和无性型对应关系上也发挥了越来越大的作用。ITS区是rDNA转录单位的一个部分，它是由两个不编码的ITS1和ITS2构成，由于ITS区相对较短，PCR容易将其扩增，且该区在属内种间具长度的保守性和核苷酸序列的高度变异性（黄勃 2001）。近年来，ITS区已成为真菌分子生物学研究中的热点。利用ITS区序列的测定结果来验证虫草有性型和无性型的对应关系也取得了很好的进展。
黄山被毛孢因其产孢细胞单生、对生或轮生，基部略膨大，向上变细，锥形或长拟纺锤形，且其分生孢子粘结成团，与被毛孢属的特征相似，故从形态上将其归为被毛孢属。在系统发育树上，黄山被毛孢和根足虫草C. heteropoda被聚在一个大的分支上，而和被毛孢属的其它种的差异明显。可见台湾虫草的无性型归为被毛孢属较为合理，且和根足虫草的亲缘关系较近。
本文利用分子生物学手段，对台湾虫草的子座和分离培养的黄山被毛孢RCEF0868菌株的rDNA的完整ITS区进行序列测定，并进行比较，结果证明分离得到的黄山被毛孢确为台湾虫草的无性型。
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