2008-3-6 12:01:44

台湾虫草及其无性型关系的分子确证

台湾虫草Cordyceps formosana Kobayasi & Shimizu于1981年在台湾首次发现，中国大陆也有报道（Li et al. 2002），应用经典的分离方法得到其无性型，经鉴定为一被毛孢属新种，命名为黄山被毛孢Hirsutella huangshanensis C. R. Li，M. Z. Fan & Z. Z. Li，并在米饭培养基和自制的虫草培养基上长出与天然虫草相似的子实体（李春如等 2005）。

被毛孢Hirsutella Pat.又称多毛孢，自1892年建属以来，迄今已报道90余种，目前在CABI Bioscience数据库中有94条记录，实际上还有少部分正式发表的种尚未收录。被毛孢与虫草的关系十分密切，在已知虫草无性型中，被毛孢属占有30多种，约占总数的1/3（梁宗琦等 1990）。随着虫草药用、保健成分的不断开发，作为一类新型天然药物--虫草的需求量也在日益增加。近几年来，由于人们过度采挖、资源破坏、生长条件的限制，虫草的种类和数量呈现明显的下降趋势，虫草资源日趋匮乏。据不完全统计1960-1964年我国冬虫夏草产量为5000-8000kg/年，而1986年却下降为100kg/年。实验表明，多种人工发酵培养得到的菌丝体，与天然虫草化学组成、药理作用基本一致（Zhu et al. 1998）。因此，加强无性型的研究，不仅有利于保护野生资源，而且更适合于工业化生产。本室近期研究表明，台湾虫草的无性型--黄山被毛孢的菌丝体和发酵液都有一定的抗肿瘤作用。因此，本实验通过分子生物学方法来确证台湾虫草及其无性型对应关系及分类地位，对开发和应用台湾虫草及其无性型具有一定的指导意义。

近年来，ITS区已成为真菌分子生物学研究中的热点。利用ITS区序列的测定结果来验证虫草有性型和无性型的对应关系，已越来越受到人们的青睐，也是一种重要的分子验证方法。Huang et al.（2001）通过比较测得的球孢白僵菌Beauveria bassiana (Balsamo) Vuillemin和球孢虫草 C. bassiana Z. Z. Li, C. R. Li, B. Huang & M. Z. Fan的ITS区序列完全一致，从而表明球孢虫草是球孢白僵菌的有性型。Chen et al.（2001）和 Liu et al.（2001，2002）通过比较冬虫夏草 C. sinensis (Berk.) Sacc.和中国被毛孢H. sinensis X. J. Liu, Y. L. Guo, Y. X. Yu & W. Zeng的ITS区序列，从分子水平上证明中国被毛孢是冬虫夏草的无性型；张泽文等（2005）通过比较古尼虫草 C. gunnii (Berk.) Berk.和古尼拟青霉 P. gunnii Z. Q. Liang ITS区序列，从基因水平上证明古尼虫草的无性阶段是古尼拟青霉。

本文以18S rDNA和28S rDNA之间的转录间隔区（ITS区）为分子指标，首次测出了台湾虫草和黄山被毛孢的ITS区（包括5.8S区）序列，并通过对台湾虫草和黄山被毛孢的ITS区序列的比较分析，从分子水平上证明了黄山被毛孢是台湾虫草的无性型。

1 材料和方法

1.1 菌株来源

台湾虫草Cordyceps formosana HS0825-01，李春如，2000年8月，采自黄山；黄山被毛孢Hirsutella huangshanensis RCEF0868，分离自HS0825-01标本，由安徽农业大学虫生真菌研究中心提供。

1.2 试剂

1.2.1 DNA提取试剂：10% SDS，苯酚，氯仿-异戊醇（24:1），DNA提取液，无水乙醇，超纯水，氯化苄。

1.2.2 琼脂糖凝胶电泳试剂：琼脂糖，0.5 × TBE缓冲液，EB（溴花乙锭），溴酚蓝。

1.2.3 PCR扩增试剂：10 × Buffer，dNTP，MgCl2，Taq酶，超纯水，DNA模板。

1.3 台湾虫草子座及菌丝DNA的提取

台湾虫草DNA的提取：取一根台湾虫草子座的可孕部分，液氮研磨至粉状，利用氯化苄法提取DNA（朱衡等 1994）。

黄山被毛孢菌丝体DNA的提取：刮取平板培养物的菌丝，同上法提取DNA。

1.4 ITS区片段的扩增