关注天然自身抗体

刘玉峰

天然自身抗体(natural autoantibody,NAA)是指在没有任何抗原主动免疫的情况下，正常机体内天然产生并存在的免疫球蛋白。历史上人们对NAA的认识经历了一个复杂而矛盾的过程，从一开始把所有的自身抗体一概看作是"可怕的自身毒素（horror autotoxicus）"，到发现并证实了NAA在正常人体内的存在，目前已逐步认识到NAA具有一系列重要的生物学功能，是机体天然免疫的重要组成部分。作为生理机制的NAA正在引起学术界的高度关注，有关NAA的研究论著数量也在迅速增多。以Natural autoantibody作为主题词在线检索PubMed数据库，1980年代共检出341篇，1990年代共检出700篇，而仅2000年一年就已达到94篇，足见对这一领域的重视程度在明显地升高，研究非常活跃。

1. 对天然自身抗体的认识逐渐深入

1．1 NAA的免疫学特性

NAA具有IgM、IgG和IgA三种同种型，在胚胎及新生儿时期主要为IgM，而成人则绝大部分属于IgG。NAA的同种型从μ链向γ链转变的机制尚不清楚，有人推测天然自身反应性B细胞本身可能具有从μ链向γ链转变的能力，而无需与T细胞进行反应，也有人认为成年个体血清中自身反应性IgG的产生有可能是天然自身反应性B细胞遭遇具有与自身表位相似的外来抗原的结果。

在与抗原结合方面，NAA具有多反应性(poly-reactivity)的特点，能够识别数种自身或/和外来的抗原。多反应性的存在并不意味着NAA完全缺乏与抗原结合的特异性，每种自身反应性NAA都具有一套与众不同的特异性靶抗原。分析NAA的分子结构，发现其互补性决定区3（CDR3）是决定多反应性的主要部位，如将一多反应性单克隆抗体的重链CDR3移植到一个本来是单一反应性的IgG分子上，可以使该IgG获得多反应活性。

早期的文献表明NAA与自身抗原的结合具有低亲和力（affinity）和高亲合力（avidity）的特点。但近年发现NAA的亲和力变异很大，解离常数多在10 -5－10 -8 M范围，有人发现对IL-1α特异的NAA的解离常数高达5×10-11M。天然自身抗体并不一定必须具有较高的亲和力才能产生有效的免疫应答。低亲和力NAA间的网络性交互反应可以产生新的生物学活性，这些活性源于网络的综合效应，而不一定为组成网络的各独立成分所具备。

缔合性（connectivity）是用来描述抗体可变区（V区）与互补的Ig可变区或淋巴细胞表面受体可变区之间反应程度的概念。NAA表现出比外来抗原主动免疫所产生的"免疫"抗体更高的缔合性。NAA能识别自体血清中Ig的独特型，可为体液免疫系统提供构建V区介导的强大的网络潜力。通过与膜表面抗原结合，NAA可以激活B淋巴细胞，来调节整个B细胞的功能状态，包括NAA抗体的表达。正常IgG对全部T细胞repertoire的选择也具有重要潜能。因此，具有缔合性的NAA在维持机体自身稳定，特别是免疫系统的自稳态中具有非常重要的作用。

1．2 产生NAA的细胞及编码基因

按照B细胞定位及表面标志的不同，可以将其分为传统的CD5-B细胞（B-2细胞）、腹腔CD5+ B细胞（B-1a细胞）和腹腔CD5- B细胞（B-1b细胞），目前多数学者认为B-1a细胞是产生NAA的主要细胞。人类胚胎期的B细胞repertoire主要表达自身反应性克隆，而此时CD5+ B细胞构成脾B细胞的50-70%，脐带血和肝B细胞的90%。但亦有资料显示CD5- B细胞也可以产生多反应性NAA，而类关节炎">风湿性关节炎和Sjogren's综合征患者循环血中CD5+ B细胞的数量增加，这些细胞被证明能够产生高亲和力的病理性自身抗体，所以NAA产生的细胞学基础尚需要进行更深入的研究加以阐明。

对人类天然自身抗体、外源性抗原诱导产生的单克隆抗体以及与自身免疫性疾病相关的单克隆抗体三者V区基因的分析研究，发现了一些它们各自抗原结合位点的基因结构特点。大多数NAA由胚系基因编码，而且实际上不发生突变，但编码NAA的胚系基因具有经体细胞突变后编码病理性自身抗体的潜能。

1．3 NAA的靶抗原

IgG和IgM天然自身抗体都各自识别一组保守的自身抗原，且保持终生稳定。用ELISA方法观察NAA的抗原特异性，发现在鼠和人类，NAA可以与许多进化上保守的膜表面抗原、胞浆内抗原及循环血中的抗原成分结合。NAA还可以与某些病理性自身抗体识别共同的自身抗原，如甲状腺球蛋白、中性粒细胞胞浆抗原、内源性因子（intrinsic factor）、因子Ⅷ（Ⅷ factor）、肾小球基底膜等。

2. 天然自身抗体具有重要的生物学功能

随着免疫学基础理论的发展和研究技术的进步，一些具有自身反应特性的抗体和免疫活性细胞逐渐被发现广泛地存在于正常的个体当中，越来越多的免疫学研究者开始认识到，自身免疫(autoimmunity)作为一种机制，不仅存在于自身免疫性疾病，也存在于正常生理情况，故有"生理性"(physiological)与"病理性"(pathological)之分。这一观念上的转变，被视为20世纪80年代以来免疫学基础理论的重大进展之一。

NAA作为"生理性自身免疫"或称"正常自身免疫"(normal autoimmunity)的重要组成部分，在维护机体免疫状态平衡、调节生理机能、防御感染、监视肿瘤等多方面具有重要的意义。综合文献中的报道，NAA的生理功能主要有以下几个方面：①通过抗原交叉反应的特性识别病原微生物，可作为防御外来感染的第一道防线；②协助清除衰老或凋亡的细胞，参与生理稳定状态的调节；③参与向T细胞递呈抗原的作用；④能够结合并封闭超抗原、中和炎症介质从而发挥抗炎活性；⑤对肿瘤的发生有监视作用，可以通过结合于恶变细胞膜表面抗原而阻抑肿瘤的发展，或协助免疫细胞进行识别和杀伤；⑥通过抗独特型作用中和自发和少量产生的病理性自身抗体，防止自身免疫病的发生；⑦通过与T细胞、B细胞表面受体的结合影响这两种免疫细胞 repertoire的形成，参与免疫系统自身稳定的调节。

3. 新的技术和方法将有力地推动天然自身抗体研究

现代免疫学领域取得的每一项成就都离不开实验技术和研究方法的进步，对于天然自身抗体也不例外。在定量免疫印迹技术（quantitative immunoblotting）问世以前，主要应用酶免疫化学方法分析天然及疾病相关自身抗体的抗原/表位特异性，所用的抗体为来自血浆的免疫球蛋白或随机融合的杂交瘤细胞产生的单克隆抗体，抗原为纯化或重组的自身抗原或相关多肽。这种采用单一蛋白为抗原的免疫化学方法具有不可避免的缺陷--即把庞杂的免疫体系看成是多种抗原-抗体反应的简单集合。定量免疫印迹技术则能够全面反映抗体对自身抗原反应的特性，从而克服上述不足。通过定量免疫印迹方法检测混合抗体(如血清)对一组自身抗原的反应，并对结果进行多元统计分析，可以定量展示自身抗体的整体自身反应特征。该方法首先将组织和细胞的提取物进行SDS－PAGE，并电转移到硝酸纤维素膜上，将膜与抗体一起孵育，然后加入碱性磷酸酶标记的二抗，显色。将显色图象扫描到计算机中，利用图象处理软件根据显色的光密度将条带转换成不同高低的峰值，进而进行免疫反应的定量研究，评估抗体的整体自身反应性，分析不同个体间整体反应模式的同质程度和差异。利用这一方法，有人比较了脐带血、儿童、成人及老年人血清IgM的自身反应模式，发现取自新生儿的IgM对自身抗原的反应模式在不同个体之间高度一致，并且限于为数很少的几种抗原，这为了解NAA的免疫学特性提供了直接的证据。

抗体库技术是20世纪90年代发展起来的一项新的抗体制备技术，用PCR方法体外扩增免疫球蛋白基因并将其克隆到噬菌体载体，利用抗体分子片段在噬菌体表面呈现的特点可以用不同的抗原直接筛选到相应的特异性噬菌体抗体。这项技术主要被用于研制治疗用人源性单克隆抗体，而在自身抗体的研究中也有较为广泛的应用。已有多项报道采集自身免疫性疾病患者外周血或病灶浸润淋巴细胞，用RT-PCR扩增抗体基因并构建噬菌体抗体库，从中成功筛选到了疾病特异性的单克隆自身抗体。在此基础上，通过分析抗体基因的序列和特性，对自身抗体产生与调控的认识有了很大的提高。然而，抗体库技术用于自身抗体的研究存在一个无法回避的问题：抗体库中所有抗体的轻、重链基因配对都是在体外人工随机组合而成的，并不能代表体内自身抗体基因VH/VL的原始搭配，这种研究结果很可能会与体内原本的状况之间存在较大差异。为了解决这一问题，许多学者进行了多种不同的尝试。有人基于对人体内B细胞多样性的判断，认为需要设法增加库容，当库容大到一定程度时（如大于108），根据随机组合的几率就有可能在抗体库中恢复抗体原始的轻、重链配对。还有人用血清中的自身抗体与抗体库中获得的抗体进行竞争抑制试验，当二者识别相同的抗原表位时即认为其来自同一个克隆。最近文献中报道的细胞内PCR(in-cell PCR)技术是一种更为直接的解决方案。该技术先将抗体产生细胞进行固定和通透处理(permeated)，细胞保持完整状态，而PCR反应体系可以进入到细胞内，在细胞内进行逆转录反应，然后用一组寡核苷酸引物在细胞内扩增抗体轻重链可变区基因并组装成单链抗体结构，将扩增得到的多样性抗体基因构建成为抗体库，就可以用不同的抗原筛选到相应的抗体。这项技术能够确保扩增出的抗体基因轻重链配对与细胞内的原始配对相同，因此特别适用于天然自身抗体编码基因的研究。

另一项在NAA研究中十分有用的技术是转基因动物技术。根据抗体基因表达的等位基因排斥定律，一旦外源抗体基因成功转染到受精卵细胞的染色体上并先于内源抗体基因表达，那么该受精卵发育成的个体将只表达一种类型的抗体――所转染基因编码的抗体，这样就为研究抗体及体液免疫提供了理想的模型。目前转基因动物技术已广泛应用于抗体功能特性、人源抗体制备、B细胞发育等方面的研究。在研究天然免疫及自身免疫方面，转基因动物也具有其他方法无法比拟的优势。目前已成功建立了多种自身抗体转基因小鼠，如Honjo的抗红细胞自身抗体转基因小鼠、Hayakawa的抗胸腺细胞自身抗体转基因小鼠、Weigert的抗DNA自身抗体转基因小鼠等，在天然自身抗体以及导致自身免疫性疾病的病理性自身抗体的研究中具有广阔的应用前景。