（中国科学院上海生物化学研究所，上海 200031）
关键词 神经生长因子 凋亡 P75
神经生长因子(NGF)是第一个被发现、也是目前为止研究得最清楚的一个神经营养因子(neurotrophic factor)。它能够促进发育中的感觉神经元及交感神经元的存活及分化，营养成熟的神经元，维持其正常的生物学功能。然而，近两年来研究发现，NGF也能诱导细胞凋亡。这一现象是在NGF一个受体亚基P75的研究中发现的，并迅速成为近一两年来生命科学界所瞩目的焦点之一。
1.以前对受体P75的认识——作为TrkA的辅助性受体
NGF受体有两个亚基：一是早期克隆的P75；二是90年代初克隆的酪氨酸激酶受体TrkA。研究发现TrkA为形成高亲和力结合位点以及介导NGF效应所必需，而P75在NGF信号传递中既不必要，也不充分。这些都使得P75长期以来被当作TrkA的辅助性受体(helper receptor)。实验发现，仅仅TrkA并不足以形成NGF高亲和力受体，例如在成纤维细胞NIH3T3中过量表达TrkA，也只检测到1%～2%的高亲和力位点(Kd=10-11M)，其余则仅表现为低亲和力结合(Kd=10-9M)，而当P75与TrkA以合适的比例共表达时，则可观察到大量的高亲和力结合位点存在，P75突变后这些位点又大大减少。另外还有实验表明，P75能够显著降低TrkA对NGF反应的阈值，例如将不表达P75的转基因小鼠中的感觉神经元取出进行体外培养，结果发现它的存活需要5倍于正常剂量的NGF。再例如，在MAH细胞中转染trkA后，NGF刺激确实可以诱导细胞长出神经纤维，但如果共转染trkA和P75，TrkA磷酸化水平可以提高8倍。这些都说明P75或通过影响与NGF结合的亲和力，或影响TrkA下游信号传递途径而发挥作用。
2.对P75的新认识——P75参与介导细胞凋亡
1996年末对P75功能的研究取得了突飞猛进的进展。两家著名的杂志Science和Nature相继发表了一系列的文章报道，在完全没有TrkA的参与下，P75可以独立介导胞内信号传递，调控细胞凋亡。
2.1 P75参与介导细胞凋亡设想的由来
这一进展得益于P75的结构研究。P75先前不引人注意，有一个原因是它的胞内域很短，似乎不足以介导胞内信号传递。然而后来，一系列具有类似结构特征的受体相继被克隆，其中包括两个肿瘤坏死因子受体(TNFR1和TNFR2)、CD40、CD30、CD27及Fas/Apo1。它们组成一个结构相关的细胞因子受体家族，其胞外域都有重复的半胱氨酸簇(cysteine cluster)，但胞内域却没有什么明显的相似之处，也缺乏任何催化域，仅仅TNFR1和Fas/Apo1有一个短短的同源区域，这一区域内的突变使得受体丧失了介导细胞凋亡的功能，因此称之为死亡域(death domain)。通过细致的序列分析及核磁共振揭示，这个家族的其它成员包括P75也存在死亡域［1］。
这个家族受体与配体结合后往往伴随着核因子NFκB的活化、作为第二信使的神经酰胺(ceramide)的产生以及JNK(c-Jun N-terminal kinase)的活化。令人兴奋的是P75也表现出相似的性质。1994年在T9神经胶质瘤细胞(只表达P75而无trkA)中发现，P75与NGF结合后使得细胞生长明显变慢，同时伴随着神经磷脂酶被活化，从而产生神经酰胺。在稳定表达P75NTR的NIH3T3细胞中，也发现NGF刺激细胞后引起一个短暂的神经酰胺释放过程。1996年Carters实验室又利用Schwann细胞(Schwann细胞在发育过程中及神经损伤后天然地只表达P75)为材料发现，NGF与P75结合后可以活化NFκB，从而其P64亚基转移到核内与DNA结合。在转基因P75的成纤维细胞中也发现，这种NFκB只特异地被NGF活化从而转位到核内的现象。此外，在大鼠寡突神经胶质细胞原代培养及中脑神经元的体外培养中都发现，NGF刺激可以诱导较长时程的神经酰胺释放，同时伴随着JNK的活化。P75诱导NFκB活化以及诱导神经酰胺产生、活化JNK的生理意义尚不明了，但P75与家族其它成员的结构及介导信号分子的相似性，使得人们设想P75参与调控细胞凋亡。
2.2 P75确实参与介导细胞凋亡
2.2.1 NGF与P75结合后诱导细胞凋亡
其实，早在1994年就有实验暗示，NGF与P75结合后可以诱导细胞凋亡。实验发现，BDNF逆行运输到小鸡isthmo-optic胞内可促进这些神经元存活，而NGF则使得这些神经元死亡率提高。当时解释为由于NGF占领部分P75，阻碍了BDNF与TrkB的结合，导致这些BDNF依赖性神经元的死亡。1996年底，有两家实验室为P75与NGF结合介导细胞凋亡提供了直接证据。其一是，Frade实验室利用只表达P75而不表达TrkA的早期视网膜细胞(早期视网膜细胞大量表达P75而不表达trkA，只是到了发育晚期才开始表达trkA，这些只表达P75的细胞在正常发育过程中会大量死亡)，发现了小鸡神经系统发育中由P75介导的自然发生的NGF诱导凋亡现象［2］。在体外培养中发现，如果加入NGF的抗体，这种死亡就可以被阻止。其二是Casacci-Bonnefi实验室利用体外培养的成熟的大鼠寡突神经胶质细胞(只表达P75)，也发现了NGF诱导细胞凋亡的现象［3］。同时，他们发现细胞死亡总伴随有神经酰胺水平的持续上升及JNK激活。一些体内实验也证实，NGF可以介导细胞凋亡。在只表达P75胞内域的转基因小鼠中，这个部分缺失的受体仍可以发挥作用，使得发育中的感觉神经元、交感神经元大量死亡，并诱导成熟的受损伤的运动神经元死亡。而在P75突变体转基因小鼠中，前脑交感神经元数目明显增加［4］。综上所述，NGF与P75结合后确实可以介导细胞程序化死亡。
2.2.2 P75可以不依赖NGF而独立介导细胞凋亡
然而又有一些实验现象使人们得出另一种结论——P75介导细胞凋亡还存在另外一种形式，在没有NGF的情况下，过量表达P75足以杀死细胞。实验发现,转染了P75的细胞比只转染空载对照的细胞死得快得多，而加入外源NGF后，细胞死亡明显减少。在过量表达TNFR1和CD95胞内域的细胞中也曾发现过这种现象。另外在感觉神经元的体外培养中发现，当转入P75反义寡核苷酸以抑制P75的表达时，存活的神经元将大大增加。这些现象都说明P75在体内可以不依赖配体而独立介导细胞凋亡，外源NGF对此有抑制作用。
以上结果都证明,P75确实参与介导细胞凋亡，但是否依赖NGF尚存在两种不同的结论，那可能是由于不同的细胞之间的差异造成的。当过量表达P75时，P75部分活化导致细胞凋亡。NGF对它的抑制可能是由于在这些细胞中有很低水平的trkA表达(以致RNA印迹检测不到)，NGF与TrkA结合后启动了促细胞存活的信号而造成的。
2.3 P75介导细胞凋亡信号传递途径的研究
大量的实验集中于研究P75的信号传递途径，但到目前还没有发现P75胞内结合的信号分子。可以确定的是，P75介导信号传递至少有两条途径——NFκB途径和JNK途径。NFκB的活化不受TrkA活化的影响，但JNK途径则受到TrkA活化的抑制［5］。
此外，利用双杂交系统(two-hybrid system)已克隆到几个P75家族其它成员的结合分子［6］。TNFR激活的下游蛋白有TRADD、TRAF1、TRAF2、TRAF3，它们可以传递死亡信号，最终导致细胞凋亡。利用同样方法，也已鉴定到一个P75结合蛋白——NRIF(neurotrophin receptor interacting factor)，一个新型的锌指结构蛋白。但它并不作为NGF下游信号分子介导凋亡。这方面的研究还在进行中。
3.细胞存亡的最终命运决定于P75与TrkA的相互作用
NGF通过P75介导细胞凋亡，这显然与人们所熟知的NGF促进细胞生长的观点相悖。细胞究竟是存是亡?TrkA活化后如何拮抗P75介导的信号?P75与TrkA究竟是协调起作用还是相拮抗?
实验表明，神经元的存亡决定于NGF两个受体P75与TrkA的比例［7］。例如P75的减少使得胚胎期的感觉神经元死亡率提高，而新生胎儿的细胞死亡率大大降低。此外，在外周神经系统的发育过程中，神经元上的两个受体的比例一直在变化，这也暗示，P75对凋亡究竟起正调节还是负调节，P75与TrkA究竟是协调还是相拮抗，决定于神经发育过程中两个受体的不同水平。但是究竟是什么机制决定了NGF的这种正负双重作用?用NGF刺激诱导凋亡的寡突神经胶质细胞为研究系统发现，转染trkA后可以抑制NGF诱导的凋亡，同时伴随着MAPK的活化、神经酰胺的产生及JNK的活化被抑制，但NFκB的活化未受到影响。由此看来，TrkA不仅启动了促进细胞存活的信号，同时抑制了P75启动的死亡信号［8］。
综上所述，细胞的存亡取决于两套信号途径的平衡，信号的强度、时程以及在信号网络中信号分子的相互交叉最终决定了细胞的命运。
NGF作为神经营养因子，除了能够维持细胞存活以外，它还参与介导细胞凋亡，这可能正是大量的神经元在神经系统发育早期死亡的原因之一。此外，在成熟的神经元受到损伤后凋亡的过程中，NGF也在其中发挥着重要作用。对于生物个体而言，NGF这种功能无疑具有突出的生理意义。
参考文献
[1]Dechant G et al.Curr Opin Neurobiol,1997,7:413～418
[2]Frade JM et al.Nature,1996,383:166～168
[3]Casaccia-Bonnefil P et al.Nature,1996,383:716～719
[4]VanderZee CEEM et al.Science,1996,274:1729～1732
[5]Yoon SO et al.J Neurosci,1998,18:3273～3281
[6]Baker SJ et al.Oncogene,1996,12:1～9
[7]Ulrich E et al.Oncogene,1998,16:825～832
[8]Carter BD et al.Neuron,1997,18:187～190
(本文原刊登在《生命的化学》1999年第2期)
