石晓冰 沈允钢
（中国科学院上海植物生理研究所，上海 200032）
关键词：ATP合酶；旋转催化；结合改变机理；质子动力势
ATP合酶广泛存在于线粒体、叶绿体、原核藻、异养菌和光合细菌中，是生物体能量代谢的关键酶。该酶分别位于类囊体膜、质膜或线粒体内膜上，参与氧化磷酸化与光合磷酸化反应，在跨膜质子动力势的推动下催化合成生物体的能量“通货”——ATP。ATP合酶的F0部分比鞭毛的动力结构的直径将近小一半。鞭毛的运动要经过几百个步骤，而ATP合酶的运动只需要几步。因此，ATP合酶的“发动机”更引人注目。
1. ATP合酶的组成
不同来源的ATP合酶基本上有相同的亚基组成和结构，由突出于膜外的F1和嵌于膜内的F0两部分组成(在叶绿体内分别叫做CF1和CF0)。F1部分由5种亚基组成，分别是α、β、γ、δ和ε亚基［动物线粒体F1还有寡霉素敏感蛋白(OSCP)亚基和抑制蛋白］。F1有6个核苷酸结合位点，其中3个为催化位点，催化ATP的合成或水解。F0嵌合在膜上，是一个疏水蛋白复合体，形成一个跨膜质子通道。在细菌中，F0由a、b和c 3种亚基组成，蓝绿藻中为a、b、b'和c亚基，在叶绿体内与之相对应的是Ⅳ、Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ4种亚基，线粒体ATP合酶的F0更为复杂。原核生物及叶绿体F1各亚基的准量关系为α3β3γδε，总分子量约400±24kD。F0各亚基的准量关系只有细菌的被确切定为ab2c10～12,推测叶绿体F0各亚基最小准量关系为Ⅳ、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ12，总分子量约为160 kD［1］。
2. ATP合酶的结构
F1是酶的膜外部分，3个α亚基与3个β亚基交替排列，形成一个对称的橘瓣状结构。F0嵌在膜上，a亚基和b亚基二聚体排列在12个c亚基形成的环的外侧。膜内和膜外的两部分由γ、ε、δ和b2等几个小亚基组成的颈部结构连接起来。连接F0和F1的颈部结构可以分为两部分：γ和ε亚基组成的位于酶的中央部位的“转子(rotor)”以及δ和b2等亚基组成的“定子(stator)”。在合成或水解ATP的过程中，γ和ε亚基在通过F0的质子流的推动下旋转，依次与3个β亚基作用，调节β亚基上催化位点的构象变化；“定子”δ和b亚基比位于酶中央的颈部结构细得多，在一侧将α3β3与F0连接起来［2］(图1)。
图1 ATP合酶的结构［2］
3. ATP合酶的催化模型
3.1 结合改变机理
在60年代初，Mitchell提出了“化学渗透学说”，认为在ATP合成过程中，跨膜的质子动力势推动ATP合酶催化合成ATP［3］。该学说被广泛接受，但对ATP合酶如何具体合成ATP还不清楚。有关ATP合酶催化机制的假说很多，最引人注目的是1993年Boyer提出的ATP合酶的催化模型——“结合改变机理(binding change mechanism)”说［4］。第一步，随着酶的构象变化，在催化位点上疏松结合的ADP和Pi与酶的结合变得紧密；第二步，紧密结合的ADP和Pi被转化成ATP；第三步就是ATP的释放。这个模型描述了每个催化亚基完成整个循环所需要经过的反应步骤，其中整个循环的三步反应中的每一步都涉及到酶的构象变化。由于构象改变是紧密相连的，在任何时间，酶的3个催化位点都处在不同的构象状态，而每一个催化位点要经过3次构象改变才催化合成一个ATP。
3.2 旋转催化
结合改变机理主要涉及的是F1上3个核苷酸催化位点在合成或水解ATP过程中的构象变化，对于整个酶来讲，β亚基上的催化位点的构象变化主要是靠γ亚基和ε亚基在催化过程中相对于α3β3的旋转运动来调节的。目前认为，ATP合酶催化合成ATP的过程是按照“旋转催化(rotational catalysis)”的模式进行的［5］。以E.coli的ATP合酶为例，腔内质子在跨膜质子动力势的推动下进入F0，与位于膜脂双层的c亚基C端氨基酸残基特异结合，导致c亚基构象发生变化；通过F0的质子转化成扭力矩推动位于F0和F1间的“转子”γ和ε亚基旋转；在γ和ε亚基的旋转调节下，F1β亚基上的核苷酸催化结合位点附近的蛋白质构象发生变化，氨基酸残基与底物ATP的氢键、疏水作用和盐桥等多种作用力消失或减弱，使ATP从酶上释放到膜外。F1上的3个核苷酸催化位点都参与了ATP的合成和释放，在整个过程中有很强的协同作用。
3.3 旋转催化的实验证据
支持“旋转催化”模型的实验证据越来越多，其中有3个实验室的工作最引人注目(图2)。
图2 验证ATP合酶在水解ATP的过程中γ亚基相对于α3β3旋转运动的3个实验的示意
(1) Cross实验室通过基因工程技术在β亚基和γ亚基上引入一些Cys,并进行化学交联实验［6］。如图2a显示，γ亚基已经和其中的一个β亚基形成二硫键，在酶水解ATP的状态下，将这些二硫键还原和再生后γ亚基可以和另外一个β亚基形成二硫键，但如体系中不加入ATP，即酶处在非活性状态的情况下，则没有形成新的二硫键。他们认为，在F1或F0F1水解ATP的过程中，γ亚基不停地旋转并与3个β亚基依次相互作用。
(2) Junge实验室应用一种新的光选择技术——光漂白偏振吸收回复(polarized absorption recovery after photobleaching, PARAP)对CF1γ亚基相对α3β3的旋转进行了实时观察(图2b)［7］。他们将纯化的菠菜CF1通过α3β3固定在离子交换树脂上，光漂白染料曙红(eosin)与γ亚基近C末端的Cys残基共价相连。当酶水解ATP时，产生畸形共振弛豫，表明γ亚基相对于α3β3作旋转运动。当把底物ATP换成AMP-PNP时，这种弛豫现象消失。γ亚基旋转的弛豫时间约100ms，与在同样条件下酶的催化周转时间相差不多。
(3) 日本的Yashida和Kinosita实验室做了一个更精彩的实验，在显微镜下直接观察到了γ亚基的旋转(图2c)［8］。他们将嗜热菌的F1通过基因工程技术在β亚基的N端尾部加上10个His，将γ亚基的106位Ser残基突变成Cys，同时将α亚基上的Cys突变成Ser。3个亚基在E.coli中表达后提纯重组，α3β3γ通过β亚基上的His尾固定在表面涂满Ni-NTA的玻璃板上，同时将荧光标记的肌动蛋白单纤维丝通过γ106Cys连接在γ亚基上，这根纤维的长度约2.5μm,是F1直径的200倍，它的运动在荧光显微镜下可以直接观察到。在有Mg2+-ATP存在的条件下，从膜方向看去，可以看到γ亚基在作逆时针旋转。
以上实验证实，游离的F1水解ATP是在α3β3的3个催化位点上按照3个步骤循环催化进行并伴随着γ亚基的旋转。F0F1全酶上，ATP的合成极有可能是γ亚基反方向的旋转催化。
4. ATP合酶旋转催化的调节
4.1 核苷酸结合位点的协同性
ATP合酶上3个核苷酸催化位点在ATP的结合上有负的协同性，在功能的行使上也有极强的偶联。结合改变机理认为，在ATP的合成/水解过程中，3个催化位点是协同参与的［4］。
Walker实验室对牛心线粒体ATP合酶F1部分的X射线晶体衍射研究为“结合改变机理”提供了结构基础［9］。很大一部分的F1的晶体是在3个催化位点呈不对称的状态下生长形成的。其中一个催化位点与AMP-PNP结合(β(ATP))，AMP-PNP是ATP的结构类似物，它可以和ATP合酶的的核苷酸结合位点结合而不被酶水解；另一个位点和ADP结合(β(ADP))；第三个位点则处在空置状态(β(E))，不与任何核苷酸结合。因为酶的一个催化位点是与非催化的ATP类似物AMP-PNP结合，所以酶的晶体结构是酶处在抑制状态下的结构。但是仍然可以把它看作是酶在旋转催化过程时的一个快照：3个催化结合位点分别处在ATP水解催化过程中的3个不同的状态，与ATP结合、空置或被ADP和Pi占据。
在酶的催化过程中，F1上的3个核苷酸催化位点有可能是按照下面的过程协同作用的(图3)［10］。在反应的不同步骤中，催化位点对底物ATP和［ADP+Pi］有不同的亲和性，分别为紧密结合状态(T态)、疏散结合状态(L态)和空置状态(O态)。在ATP合酶水解ATP的过程中，ATP和O态的核苷酸结合位点结合，使该位点由O态转为T态，进而ATP水解，该位点变成结合［ADP+Pi］的T态；与此同时，另一个与［ADP+Pi］T态结合的位点转变为L态，与第三个位点成L态结合的［ADP+Pi］释放出来，该位点由L态转变为O态。水解ATP释放的能量用于H+的转运。在ATP合成过程中，反应则按相反方向进行。即在跨膜质子动力势的推动下，O态的结合位点与［ADP+Pi］结合，然后是O→L→T态的转变，进而［ADP+Pi］合成ATP，最后ATP从T态的核苷酸结合位点上释放出来。在整个反应过程中，跨膜质子动力势ΔμH+是反应的推动力。在催化形成ATP的过程中，每一个催化位点均经历相同的状态变化；在任一时刻，3个催化位点分别处于不同的核苷酸结合状态；每一次结合改变，酶释放一个ATP。
图3 β亚基上3个核苷酸催化位点在ATP合成过程中的协同作用
4.2 质子动力势促进扭力矩的形成
F0的作用之一就是，将跨膜质子动力势转化成扭力矩，推动F1部分的γ和ε亚基旋转。在大肠杆菌ATP合酶中，质子通过F0的转运需要a、b、c 3种亚基参与。a亚基至少含有5个跨膜α螺旋，其第四个α螺旋上的Arg210被认为是H+转运所必需的。b亚基是单穿膜亚基，还有一个很长的亲水头。c亚基由两个跨膜的α螺旋和一个突出的细胞质侧膜外的小环组成一个发夹结构［2］。电镜观察显示，多拷贝的c亚基在膜内形成一个环状结构。c亚基上第二个跨膜螺旋上的Asp61被认为是F0上的H+结合位点，它的质子化/去质子化循环可以转运H+。在H+转运偶联ATP合成的过程中，a亚基Arg210和其中一个c亚基的Asp61产生瞬时的盐桥，降低了Asp61的羧基的pKa。c亚基Asp61的质子化/去质子化会引起其极性环结构的改变，从而改变ε亚基和γ亚基的极性环相互作用［11］。当环上的一个c亚基脂蛋白与a亚基接触时，c亚基环的旋转波动就会被限制在一个小角度的范围里。质子与c亚基结合，使c亚基失去电中性，c亚基环继续旋转运动。环是顺时针还是逆时针旋转，取决于质子是从膜的哪一侧的通道进入。如果从下部(即膜的内侧)的通道进入，那么从F0的底部看，c亚基环是顺时针旋转的。当膜内外pH梯度相反时，环向相反的方向旋转。环的旋转是靠跨膜的质子动力势推动的。根据质子动力势的定义：μH+=-2.3RTpH+FΨ(F：法拉第常数，Ψ：电位势)，pH值和电位势是随着通道的长短不同而变化的，含正电荷较多的内膜侧的通道更易质子化［2、11］。
4.3 H+转运和ATP水解/合成的偶联
在ATP合酶转运H+和水解/合成ATP的偶联过程中，“转子”γε亚基有着重要作用。ε亚基与γ亚基有很高的亲和力，两个亚基结合在一起，在酶的中央共同旋转以调节β亚基上催化位点的开放和关闭。交联实验显示，ε亚基与α、β、γ和F0的c亚基均可作用。ε亚基有两个结构域，N端为10个β折叠形成的桶，或叫三明治结构，C端是两个α螺旋形成的发夹结构。ε亚基的两部分不对称结构在亚基的结合中有不同的作用：C端的α螺旋与酶的核苷酸结合位点相作用，β桶结构则与γ亚基和F0的c亚基相作用。ε亚基是合成ATP所必需的亚基，有抑制酶水解ATP的活性，同时还有堵塞质子通道、减少质子泄露的功能。我们的研究表明，ε亚基还可以影响光系统Ⅱ水氧化释放质子的区域化［12］。
ATP合酶的F0转运H+，γε旋转120°，一个T态的β亚基释放一个ATP。ATP的合成和H+的转运偶联的具体过程有可能是按下述方式进行［13］：(1) F0的a亚基与c亚基结合，使c亚基Asp61从高的pKa态变成较低的pKa态，c亚基从膜内侧获得一个H+，同时γε与c亚基的极性环结合；(2) a亚基与c亚基解聚，c亚基的Asp61重新回到高pKa态，Asp61的羧基移动到低H+活力的膜外侧，H+从高pKa态的Asp61位释放出来，同时c亚基的极性环与γε亚基解聚。γε与F0的a亚基或b亚基的非对称结合使γε按照一定的方向(顺时针或逆时针)与下一个低pKa态的c亚基极性环结合。F0上H+的转运积累足够的扭力矩推动γε相对于α3β3旋转120°，而γε通过与β亚基核苷酸结合位点的作用使β(ATP)亚基释放一个ATP，同时调节β(E)和β(ATP)停止或重新转向对核苷酸的“捕捉”状态。
参考文献：
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（本文原刊登在《生命的化学》1999年第5期）
