蛋白芯片生产用醛基化玻片制备的条件优化及初步检定（一）

丁亚平¹ 倪世明¹  陈立炎¹  张文¹  曹恒杰¹  罗予春¹  周枚芬¹  梁好¹  凌志光¹  王升启²

1.深圳益生堂生物企业有限公司，深圳

2.军事医学科学院放射医学研究所，北京

摘要：建立一种以玻片为基质的蛋白芯片制备的优化及检定方法。将经过清洗处理的玻片，用不同浓度的氨基硅烷试剂和戊二醛试剂，在不同的时间内，进行氨基化和醛基化处理，通过蛋白结合强度与处理时间及溶剂浓度的动力学相关性分析，确定最佳的优化条件，将不同浓度梯度的人IgG抗体结合于该玻片表面，经过洗涤、封闭，再加入Cy3荧光标记的二抗，孵育，洗涤后检测各点的荧光强度，确定其线性范围及其检测灵敏度。氨基硅烷试剂浓度为5%，作用时间为30min，戊二醛试剂浓度为2.5%，作用时间为60min时，蛋白结合强度达到饱和。蛋白芯片在2~2×10^-7mg/ml浓度范围内有良好的线性，能够检测出人IgG的最低浓度为2×10^-8mg/ml。

关键词：蛋白芯片；制备；氨基硅烷；戊二醛

中图分类号: Q81 文献标识码：A

生物芯片以其高通量多靶位的检测模式正在越来越多地应用于生物科研领域，在这方面，基因芯片（DNA 芯片）的应用比蛋白芯片的应用要成熟，而蛋白芯片的应用则落后于基因芯片。

基因芯片在研究基因表达、基因多态性以及检测基因突变方面具有不可替代的作用^[1,2,3]。但是，细胞的各项功能机制是通过表达的蛋白来完成的，单独分析DNA和RNA并不能完全阐明各种生物机能，研究表明mRNA的检测风丰度与其相应的蛋白表达具有明显的差异性^[4,5]，并且蛋白质的翻译后修饰，蛋白与蛋白之间、蛋白与DNA之间的相互作用对细胞活动有重大影响。通过单独研究DNA和mRNA并不能认识这种影响。这也是目前后基因组时代蛋白芯片的研究逐步变为热点的原因。

目前研究多种蛋白表达及相互作用机制的方法除了采用两维SDS-PAGE和质谱分析^[6]之外，另一种就是采用蛋白微阵列方法，该方法将抗原抗体反应的原理与芯片的高通量多靶位检测相结合，不需要复杂的仪器设备，检测扫描等仪器与DNA芯片相通用，在蛋白质组研究^[7,8]、临床致病微生物检测^[9]、肿瘤细胞蛋白检测^[10]、自身抗体检测^[11]以及细胞因子^[12]的检测方面取得了初步结果。

作为制作芯片常用的基质，玻片具有廉价、表面光滑、检测本底低等优点，已被广泛用于基因芯片的制备。有报道用玻片制作蛋白芯片^[13]，通过抗原抗体反应来检测样本，但对蛋白芯片制备过程的优化条件及玻片的检定却缺乏相关资料。目前玻片表面的活化主要采用氨基硅烷和戊二醛先后进行氨基化和醛基化反应^[14,15]，在玻片表面形成活化的醛基，与蛋白质的氨基缩合反应，形成共价键。本实验用氨基硅烷和戊二醛试剂，通过蛋白结合力检测，确定了玻片蛋白结合力与试剂浓度、作用时间的动力学相关性，为蛋白芯片的制备提供了可供参考的最佳条件。

I 材料与方法

1.1 材料

Cartisian机器人点样系统；Scan Array 3000激光共聚焦扫描仪；载玻片（ERIE Scientific 公司）。

氨基硅烷试剂N（3-Aminopropyltriethoxysilane；ATES，Sigma公司）；戊二醛（Sigma公司）；人IgG（华美生物工程公司）；Cy3荧光标记的兔抗人IgG Fc段抗体（Sigma公司）；小牛血清（杭州四季青公司）；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

将玻片分别用强碱和浓硫酸浸洗；双蒸水冲洗，晾干。

1.2.1 玻片氨基化 配制氨基硅烷的乙醇溶液，浓度分别为1%、2%、5%、10%，将玻片浸入上述溶液中分别作用5、10、30、60min，取出水洗，晾干。

1.2.2 玻片醛基化将上述氨基化处理的玻片分别浸入1%、2.5%、4%的戊二醛PBS（0.2mol/L，pH8.0）溶液中，分别作用10、30、60、90min，PBS溶液清洗晾干。

1.2.3 醛基片吸附结合抗原能力的检测玻片贴覆隔珊膜，用Cartisian机器人点样系统将人IgG（1mg.ml）按4×4 矩阵分别点于10 个孔内，37℃温孵2h，PBS-T（0.01mol/L，pH7.2，0.05% Tween20）洗涤4次，10s/次；同等条件下，再以含10%小牛血清的0.02mol/L PBS溶液封闭1h。双蒸水清洗，晾干后，将Cy3标记的羊抗人IgG Fc段抗体以1:500稀释，加入各孔，每孔加20ml，孵育30min，PBS-T洗涤4次，每次10min，最后用双蒸水冲洗，用ScanArray3000扫描，扫描仪的激光强度设定为80%(以下同)，光电倍增管强度设定为80%。用Imagene4.0图像分析软件进行荧光强度分析。计算各孔每个矩阵的平均荧光强度，再计算出10个孔的平均荧光强度，以此来判定共价结合吸附的强弱。

1.2.4 蛋白芯片的灵敏度及线性的检测 将人IgG倍比稀释成2×4⁰~2×4^-9mg/ml；用Cartisian机器人点样系统将每种浓度的人IgG分别点于玻片表面，每个浓度点2个点，37℃温孵2h，下的洗涤，封闭，与二抗荧光标记物反应等步骤同上。用ScanArray3000扫描后。进行Imagene4.0软件图像分析，荧光强度分析。计算各浓度梯度点的平均荧光强度，每个点荧光强

度为该点荧光强度绝对值减去周围背景荧光强度。所得数据进行线形回归分析。确定线形范围和最低检出浓度。

2 结果

2.1 不同氨基硅烷浓度和作用时间对结合强度的影响

各种氨基硅烷浓度在每个时间点分别作一张玻片，戊二醛浓度为4%，反应时间为1.5h，其它操作见材料和方法。结果用方差分析Q检验进行统计学分析。各浓度在5、10、30 min作用时间点上的结合力有显著差异，与作用时间呈正相关（P<0.05）。30 min和60 min作用时间点上无显著差异（P>0.05）。

说明作用30 min时，氨基化强度进入平台期。各作用时间点上，浓度为1%、2%、5%时，结合力与浓度呈正相关，但在5%和10%两个浓度在各时间点上结合力均无显著差异（P>0.05），所以5%为氨基硅烷化试剂的饱合浓度（图1）。

2.2 不同戊二醛浓度作用不同时间对玻片结合力的影响

将氨基硅烷浓度定为5%， 作用时间定为30 min，分别考察1%、2.5%、4%三种浓度的戊二醛PBS

溶液在分别作用10、30、60、90 min的情况下，对玻片共价结合力的影响，其它操作方法见材料与方法，结果随着戊二醛浓度增加玻片结合力相应增加（P<0.05），但浓度增加至2.5%时，结合力不再显著增加（P>0.05）。作用时间增加，结合力亦增加（P<0.05），但作用时间超过60 min后，结合力不再显著增加（P>0.05）。上述实验显示，戊二醛浓度为3.0%，作用时间为60 min为饱和活化条件（图2）。