杜桂鑫 侯利华 陈万荣 刘树玲 张永国 孙大铭 王海涛
军事医学科学院微生物流行病研究所,北京,100071
摘 要：根据丙型肝炎病毒(HCV)丝氨酸蛋白酶晶体结构特点,设计并构建了一种新的单链型丝氨酸蛋白酶分子.该分子由辅因子NS4A的核心序列、柔性连接子GSGS和NS3丝氨酸蛋白酶结构域组成.利用设计的3条引物,通过2轮PCR获得单链丝氨酸蛋白酶基因,插入原核表达载体pQE30中,转化大肠杆菌M15,获得重组克隆.经低剂量诱导和低温培养,目的基因获得高水平可溶表达.以金属螯合层析法纯化的重组蛋白纯度达95%以上.间接ELISA法检测98份血清证实,该蛋白具有良好的抗原性和特异性;以重组蛋白底物NS5ab,和单链丝氨酸蛋白酶建立了简便、实用的丝氨酸蛋白酶体外活性检测系统;以该系统观察了PMSF和EDTA对蛋白酶活性的影响.结果表明,PMSF能够抑制蛋白酶的酶切活性,而EDTA不能抑制酶的活性.单链型HCV丝氨酸蛋白酶的成功表达以及体外活性检测系统的建立,为丝氨酸蛋白酶抑制剂的研制奠定了物质基础.
关键词：丙型肝炎病毒,丝氨酸蛋白酶,基因表达
分类号：R373.3+3 文献标识码：A
