廖名湘 左瑾 刘东远 方福德
摘 要 目的 探讨谷胱甘肽S-转移酶(GST-P)基因表达调控机制的多样性及其与化学致癌的关系，筛选与大鼠GST-P增强子元件GPEⅠ相互作用的调控因子。方法 采用酵母单杂交体系筛选与GPEⅠ核心序列相互作用的转录激活因子，应用DNA序列测定及计算机分析等手段对所测的DNA序列进行分析。 结果 共获得两个阳性克隆pYGPE1和pYGPE2。DNA测序分析表明：pYGPE1的插入片段与大鼠原癌基因c-jun cDNA具有99%的同源性，其编码的氨基酸序列与大鼠c-Jun蛋白具有100%的同源性。pYGPE2的插入片段与大鼠线粒体腺苷酸转位酶cDNA具有99%的同源性，其编码的氨基酸序列与大鼠腺苷酸转位酶具有100%的同源性。结论 大鼠c-Jun蛋白和线粒体腺苷酸转位酶在酵母细胞内与大鼠GST-P增强子GPEⅠ核心序列结合，可能是作用于GPEⅠ的反式作用因子。
关键词：酵母单杂交体系；谷胱甘肽S-转移酶；增强子GPEⅠ；转录激活因子
大鼠谷胱甘肽S-转移酶P (glutathione S-transferase P, GST-P)在正常大鼠肝细胞中不表达［1］，但在化学致肝细胞癌变的早期可被特异性诱导而表达，因此学者们认为GST-P是大鼠肝癌的可靠的标志物［2］。GST-P基因在被诱导表达的过程中，转录激活是一个关键的步骤，顺式调控元件与转录激活因子之间的特异的相互作用是转录激活得以实现的先决条件。GST-P基因的增强子位于GPEⅠ和GPEⅡ两个小区域内，其中GPEⅠ在GST-P基因的诱导表达中起主要作用。尽管佛波酯(TPA)类化合物能通过GPEⅠ诱导 GST-P的表达［3］，研究证明GPEⅠ也可在体外结合AP-1［4］，但GPEⅠ在未分化的F9胚胎干细胞中也有活性，而F9细胞系的AP-1活性非常低，这一现象提示：GPEⅠ可能不是通过经典的AP-1依赖形式进行调控的。有证据表明GPEⅠ的2个佛波酯应答元件(TRE)类似元件能与Jun结合，二者协同作用增强转录活性。但是共转染c-jun和c-fos只能轻微激活GPEⅠ介导的GST-P基因的转录，提示除了AP-1之外，还有其他因子影响GPEⅠ［4］。本研究采用酵母单杂交体系，对能结合于GPEⅠ的因子进行探讨，旨在阐明大鼠GST-P基因激活转录的机制。
材料和方法
材料 MATCHMAKER 酵母单杂交体系及其有关酵母单杂交体系所用试剂，如培养基YPD、Minimal SD Base及各种DO Supplement 均购自美国Clontech公司。3-AT、玻璃珠和蜗牛酶等购自Sigma公司。大鼠肺MATCHMAKER cDNA 文库为Clontech公司产品。
以酵母单杂交体系筛选cDNA克隆 靶元件为包含GPEⅠ核心序列5′-TTGCTGAATCA-TAGTGACTGACTA-3′和5′-TAGTCAGTCACT-ATGATTCAGCAA-3′的串联三聚体，其片段两端分别加入EcoRⅠ和XbaⅠ或EcoRⅠ和SalⅠ限制性内切酶识别DNA序列(由 上海生工生物有限公司合成)。参照酵母单杂交体系说明书的方法，将以上DNA片段分别插入HIS3报告质粒和LacZ报告质粒的启动子上游，构成目的质粒pGPEH1和pGPEL。以上两种质粒经限制性内切酶线性化后，依次转入YM4271酵母菌株，并整合于其染色体上，得到一种报告酵母菌株YMGPE(此报告菌株可在尿嘧啶和组氨酸双缺陷的平板上生长)。以大鼠肺MATCHMAKER cDNA文库质粒转化酵母菌株YMGPE，在含15 mmol/L 3-AT的SD/-Leu/-Ura/-His(亮氨酸、尿嘧啶和组氨酸)缺陷平板上进行筛选。挑选大菌落(直径＞2 mm)转移到Whatman#5滤纸上行β-半乳糖苷酶(β-gal)活性分析。滤纸浸入液氮30 s后取出，于30℃在含0.8 mmol/L
6-溴-4-氯-3-碘-β-D半乳糖苷的Z buffer/x-gal的溶液中孵育，颜色变蓝的菌落为阳性克隆。从阳性克隆中提取候选质粒，再次转入YMGPE，重新验证His+表型和β-gal活性。
质粒文库滴度的测定及扩增 参见MATCHMAKER GAL4 Two-Hybrid使用手册。按常规的碱裂解法制备质粒DNA。
酵母质粒的提取及以酵母质粒转化大肠杆菌 用蜗牛酶提取酵母质粒，选用电转移法将所提取的质粒转入大肠杆菌DH5α，将电转化复苏后的细胞铺于Amp+平板上，37℃培养24～36 h。
PCR扩增及限制性内切酶酶解反应 按常规方法进行。引物1：5′-GATGATGAAGATACCCC-ACCAAACC-3′，引物2：5′-CTTGCGGGGTTTT-TCAGTATCTACG-3′。同时选择位于插入片段两端载体上的限制性内切酶BglⅡ识别DNA序列，进行酶切鉴定。
DNA序列测定 采用美国应用生物系统公司生产的377A DNA序列仪测定。
核酸序列的分析 以Clone(4.0)核酸蛋白序列分析软件对所测的DNA序列进行分析，并根据GenBank数据库提供的数据进行同源性分析。
结 果
酵母单杂交体系对大鼠肺MATCHMAKER cDNA文库的筛选结果 用200 μg大鼠肺MATCHMAKER cDNA文库质粒转化酵母菌株YMGPE，文库质粒的转化效率为2.6×104 cfu/μg DNA， 共获得约5.2×106个转化子。转化子总数大于大鼠肺MATCHMAKER cDNA文库的独立克隆数(3.5×106个)，可以满足筛库要求。以能在SD/-Leu/-His/-Ura选择平板上生长、直径＞ 2 mm的克隆为阳性标准，结果共获得47个His+阳性克隆。对这47个阳性克隆再进行β-gal活性分析，结果表明，其中13个克隆显示较强的β-gal活性。图1示β-gal活性检测结果。
图 1 由筛选大鼠肺MATCHMAKER cDNA 文库获得的His+菌株的β-半乳糖苷酶活性分析结果
Fig 1 Results of measuring the activity of β-galactosidase in His+ strain from screening the rat lung MATCHMAKER cDNA library
the color of His+LacZ+is blue(↑)
相同克隆的排除 将大鼠肺MATCHMAKER cDNA文库质粒电转移入大肠杆菌DH5α，使之在大肠杆菌内得以扩增，从而获得较少污染的大量质粒。以pACT2载体多克隆位点两侧的特异引物扩增插入片段，同时用该载体插入片段两侧合适的内切酶进行酶切反应。分析电泳图谱后，共获得5个单一的克隆(图2)。
图 2 His+LacZ+菌株中大鼠肺cDNA文库质粒插入片段的PCR产物和限制性内切酶BglⅡ酶切结果
Fig 2 PCR products of the inserts and the excision results with Bgl Ⅱfrom His+LacZ+ yeast strains
screening the rat lung cDNA plasmids library
A.PCR products of the inserts from the rat lung plasmids library
1.pBR322/BstNⅠ marker; 2.negative control; 3～11.PCR products; 12.λ-DNA/Hind Ⅲ marker
B.the excision results of plasmids with Bgl Ⅱ
1.pBR322/BstNⅠ marker; 2～9.the excision results of with Bgl Ⅱ; 10.λ-DNA/Hind Ⅲ marker
假阳性克隆的排除 用5个阳性克隆的候选质粒重新转化报告酵母菌株YMGPE，其中2个恢复了HIS和LacZ活性，表明这2个克隆确实是阳性克隆(图3)。将此2个质粒分别命名为pYGPE1和pYGPE2。
图 3 阳性克隆的候选质粒重新转化报告酵母菌株YMGPE 后β-半乳糖苷酶活性分析结果
Fig 3 Results of measuring the activity of β-galactosidase in YMGPE strain transformation with the candidate plasmids isolated from positive clone
the color of His+LacZ+is blue
阳性克隆的序列测定及同源性分析 对pYGPE1和pYGPE2进行了部分序列的测定，并以Clone(4.0)软件对测序所得的cDNA序列进行编码蛋白质读框的预测，预期结果经GenBank进行cDNA和蛋白质序列的同源性比较。结果表明：pYGPE1的插入片段与大鼠c-jun原癌基因的cDNA序列具有99%的同源性，其编码的氨基酸序列与大鼠c-Jun蛋白具有100%的同源性；pYGPE2的插入片段与大鼠线粒体腺苷酸转位酶的cDNA序列具有99%的同源性，其编码的氨基酸序列与大鼠腺苷酸转位酶具有100%的同源性。
讨 论
Muramatsu等［5］的研究表明，AP-1和其他一些因子能结合于GPEⅠ上，从而对肝细胞癌变过程中GPEⅠ介导的GST-P高水平转录起作用，但AP-1对GPEⅠ的影响极小，其他未知因子在GST-P的诱导表达中起着非常重要的作用。也有研究对以上结果提出疑问，认为AP-1是否在GST-P的诱导表达中起作用还不能确定，因为Jun和Fos的表达不总是与GST-P的表达一致［4，6］。为确定与GPEⅠ结合的转录激活因子，从而研究化学物质致癌的机制，笔者曾采用电泳迁移率变更分析(EMSA)比较了不同细胞结合于GPEⅠ上的反式作用因子，结果表明HeLa、CBRH7919细胞中均存在与GPEⅠ特异性结合的蛋白质因子，而在正常大鼠肝细胞中不存在与GPEⅠ特异结合的反式作用因子，由此证明，癌细胞中确实存在与GPEⅠ特异结合的反式作用因子［7］。此外，TPA能促进带有GPEⅠ增强子的荧光素酶报告基因的表达［8］。由于GPEⅠ的核心序列由两个尾尾相对的TRE类似序列组成，故有理由认为TPA可能是通过激活AP-1或相应的转录因子与TRE样序列相互作用而促进GST-P表达的。以上体外实验说明，多种因子能与大鼠GST-P基因的增强子GPEⅠ结合，从而诱导GST-P的表达，其中Jun很可能是与GPEⅠ结合的反式作用因子。本研究采用酵母单杂交体系，在酵母细胞内进一步证明了转录激活因子Jun确实能与GPEⅠ结合。因酵母属于真核生物，故在酵母细胞内获得的结果比在体外获得的结果更能反映真核基因表达调控的真实情况。由本研究的结果可以推测大鼠c-Jun的DNA结合结构域位于第171～334位氨基酸所组成的区域内。据文献报导，大鼠c-jun cDNA克隆编码334个氨基酸残基，其氨基酸序列与小鼠、人和鸡c-jun基因编码产物的同源性分别为98%、96%和81%。其氨基端60个氨基酸序列在哺乳动物中是高度保守的，而与鸡有很大的差异性。紧随其后的62个氨基酸(第61位至第122位氨基酸)和羧基端116个氨基酸(第119位至第334位氨基酸)在所有物种及病毒Jun中几乎完全相同。c-jun产物距羧基端的100个氨基酸对于其功能是非常重要的，这个结构域可能形成碱性亮氨酸拉链结构(bZIP)，c-Jun蛋白通过这一区域与Jun本身或其他反式作用因子形成同源或异源复合物，与AP-1位点结合，在蛋白-蛋白相互作用以及蛋白-DNA相互作用中发挥重要作用。位于中间的97个氨基酸(第122位至第219位氨基酸)的同源性在不同物种中相对较低，大鼠c-jun产物与人、小鼠和鸡的同源性分别为88%、96%和55%；c-Jun在此区域的作用不如氨基端和羧基端区域重要［9］。本实验所筛选到的cDNA编码的氨基酸构成的区域的确包含Jun的DNA结合结构域。
另外，本研究还发现了另一个与GPEⅠ核心序列特异结合的蛋白质，即大鼠线粒体腺苷酸转位酶(adenine nucleotide translocase),它在酵母细胞中与GPEⅠ具有很强的结合力。大鼠线粒体腺苷酸转位酶的基因位于染色体上，在细胞胞浆中经过加工后定位于大鼠线粒体内膜上，形成线粒体内膜上的整合蛋白质。大鼠线粒体腺苷酸转位酶负责线粒体内外的ATP和ADP的交换，使ATP的产生与ATP的利用联系起来，因此在生物的氧化磷酸化过程中发挥重要作用［10］。目前，尚鲜见关于大鼠线粒体腺苷酸转位酶作为转录因子参与转录调控的报道。那么，大鼠线粒体腺苷酸转位酶在大鼠GST-P的转录调控中是否起作用?其作用的机制如何?其在细胞胞浆中加工后的产物如何重新入核?所有这些问题均需进一步研究。
国家自然科学基金(39670173)资助
廖名湘(中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室，北京 100005)
左瑾(中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室，北京 100005)
刘东远(中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室，北京 100005)
方福德(中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室，北京 100005)
参考文献
1，Sato K. Glutathione transferases as markers of preneoplasia and neoplasia. Adv Cancer Res, 1989,52:205-255
2，Imai T, Masui T, Ichinose M,et al. Reduction of glutathione S-transferase P-form mRNA expression in remodeling nodules in rat liver revealed by in situ hybridization. Carcinogenesis,1997,18(3):545-551
3，Okuda A, Imagawa M, Sakai M, et al. Functional cooperativity between two TPA responsive elements in undifferentiated F9 embryonic stem cells. EMBO J,1990,9(4):1131-1135
4，Sakai M, Muramatsu M, Nishi S. Suppression of glutathione transferase P expression by glucocorticoid. Biochem Biophys Res Commun,1992,187:976-983
5，Diccianni MB, Imagawa M, Muramatsu M. The dyad palindromic glutathione transferase P enhancer binds multiple factors including AP1. Nucleic Acid Res,1992,20(19):5153-5158
6，Morimura S, Okuda A, Sakai M,et al. Analysis of glutathione transferase P gene regulation with liver cells in primary culture. Cell Growth Differ,1992,3:685-691
7，刘东远，廖名湘，方福德.大鼠谷胱甘肽S-转移酶P1基因增强子及其反式作用因子的研究.自然科学进展，2000，10(3)：235-239
8，廖名湘，刘东远，左 瑾，等.三种化学诱导物对大鼠GST-P基因表达的影响及机理.科学通报，1999，44(23)：2550-2553
9，Sakai M, Okuda A, Hatayama I,et al.Structure and expression of the rat c-jun messenger RNA: tissue distribution and increase during chemical hepatocarcinogenesis.Cancer Res, 1989,49:5633-5637
10，Klingenberg M.The ADP-ATP carrier in mitochondrial membranes In: Martonos AN， eds. The enzymes of biological membranes.v5.membrane transport.New York: Plenum Publishing Corp,1976.383-438
中国医学科学院学报2000年第22卷第4期
