应用蛋白质芯片进行蛋白质活性的整体分析

为了推动酵母蛋白质组的研究，我们克隆了5800个开放阅读框，进行过量表达及蛋白纯化。这些蛋白被高密度地点印到载玻片上制成酵母蛋白质芯片，筛选这些蛋白质与其它蛋白质和磷脂相互作用的活性。我们鉴定出许多新的可与钙调蛋白和磷脂相互作用蛋白；还发现许多钙调蛋白结合蛋白可能共同的一个结合基元。这样，就能制成一个完整真核蛋白质组芯片来筛选各种生化活性。它们还可应用于筛选蛋白药物相互作用和检测翻译后修饰。

在后基因组时代的一项主要任务就是去弄明白每一个所编码的蛋白质的功能、修饰和调控⁽¹⁾。最近，已通过分析mRNA表达谱、基因断裂型、双杂交作用和蛋白质的亚细胞定位来研究基因和蛋白的功能和调控⁽²⁾。尽管这些研究很有意义，通过分析这些生化活性也能推导出许多关于蛋白质功能的信息^(3-7)。从原理上讲，可以通过高通量方式来生产蛋白质并利用蛋白质芯片来一次平行分析出成千上万个蛋白质样品的生化活性^(5，6，8)。筛选一个完整蛋白质组芯片的主要问题是有必须的表达克隆和高效表达并纯化的蛋白质。

我们构建了一酵母蛋白质组芯片，包含了大约80%的酵母蛋白，来筛选一些生化活性。我们首先将5800个（占总共的93.5%）酵母开放阅读框克隆到酵母高拷贝表达载体上⁽⁹⁾。这些酵母蛋白的氨基端都融合到GSF-HisX6上，使用可诱导的GAL1启动子，在酵母中表达^(5，9)。这些表达酵母菌株包含有独立的质粒，DNA序列测定表明其含有正确的酵母ORF框并且连接在GST上。这些蛋白都在酵母中表达以确保蛋白质被正确修饰和折叠。采用一96孔板，利用谷光苷肽琼脂糖珠从酵母提取物中迅速地纯化出1152个样品⁽¹⁰⁾。在裂解液中加入了0.1%Triton并洗涤以保证纯化的蛋白不含磷脂。利用免疫印记分析随机的60个样品来监测纯化蛋白的质量和数量（图1A）。超过80%的菌株产生可检测到的预期大小的融合蛋白。

为了准备蛋白质芯片，代表5800种不同蛋白的6566个蛋白样品通过商业购买的点样仪印到玻璃载玻片上。起先我们用的是乙醛处理的载玻片，融合蛋白通过N端的起始胺或蛋白的其它残基与载玻片相连⁽⁶⁾。后来我们将蛋白点在涂镍的载玻片上，融合蛋白通过HisX6尾连到玻片上，它们差不多都统一朝向玻片表面。尽管两种芯片都很成功，但涂镍的载玻片可给我们特殊蛋白质芯片以更好的信号（图1B）。

为了检测多少融会蛋白共价的结合到不同的玻璃表面和蛋白吸附的再生性，我们用抗GST的抗体来检测芯片。超过93.5%的蛋白样品有显著信号（也就是超过10fg的蛋白），超过90%的点包含10-950fg蛋白。我们的结果证明了在溶解良好的条件下，一个标准的载玻片的一半区域上可以点13，000个蛋白样品（图1C）。为了检验点的蛋白质的重复性，将相同的两个点的信号进行对比。95%的信号相差不超过5%⁽¹⁰⁾。

蛋白质芯片还经过数次的蛋白-蛋白和蛋白-脂质相互作用来检测。为了测定蛋白-蛋白之间作用，在钙存在的条件下用生物素标记的钙调蛋白来检测酵母蛋白质⁽¹¹⁾。钙调蛋白是一种非常保守的结合钙的蛋白，与许多钙控制的细胞过程有关，并有很多配偶体⁽¹²⁾。生物素结合的蛋白质是使用Cy3标记抗生蛋白链菌素来检测。我们也用一个Cy3单独标记抗生蛋白链菌素来做为对照。这些研究鉴定出6种已知的钙调蛋白靶标（图2A）：Cmk1p和Cmk2p是典型的I类和II类钙/钙调蛋白依赖性的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶⁽¹²⁾，Cmp2p是两种酵母钙调磷酸酶中的一种⁽¹³⁾， Dst1p在转录延伸期中其重要作用⁽¹⁴⁾，Myo4p是一V类肌球蛋白重链⁽¹⁵⁾，Arc35p是Arp2/3肌动蛋白组织复合物的一个成分⁽¹⁶⁾。Arc35p在最近的双杂交研究中表明可与钙调蛋白相互作用⁽¹⁷⁾；我们的数据证实了Arc35p和钙调蛋白的体外相互作用。有6种已知的钙调蛋白靶标而我们没有检测到的，其中两个是我们没有收集到，其它的是在GST检测实验中不能被检测到的。除了已知的配偶体外，还找到33种另外的钙调蛋白可能配偶体。这些包括许多不同类型的蛋白（表1）⁽¹⁰⁾，这与钙调蛋白在许多种细胞过程种的重要作用相符。

序列研究表明⁽⁵⁾39个钙调蛋白结合蛋白中14个有一基元I/L-Q-X-X-K-K/X-G-B，X表示任何残基，B是基础残基（图2B）。在肌球蛋白中的一个相关序列，I-Q-X-X-X-X-K-X-X-X-R，早先就表明能够结合钙调蛋白⁽¹⁸⁾。我们证实了这个结构域包含在许多钙调蛋白结合蛋白中。其它缺少此基元的标靶可能含有其它钙调蛋白结合序列⁽¹⁰⁾。

除了钙调蛋白结合蛋白外。我们还鉴定出一结合Cy3标记的抗生蛋白链菌素蛋白，Pyc1p。Pyc1p编码一丙酮酸羧化酶1的同系物包含一高度保守的生物素结合区⁽¹⁹⁾。这样，就如根据它的序列预测的，Pyc1p可在体内结合生物素。结合适当的检测，我们希望蛋白质芯片能够鉴定出许多转录后修饰蛋白。

为了检验蛋白质芯片能够用于其它方法不能检测到的活性,如蛋白质-药物、蛋白质-脂质之间的相互作用，我们用它来筛选磷脂酰肌醇(PI)的结合蛋白。PI是细胞膜的重要成分，并且是控制许多细胞过程如生长、分化细胞骨架重排、膜运输等的第二信使⁽²⁰⁾。因为它们通常出现的时间很短暂，并且在细胞中的量也很少。PI还没有被广泛的研究，也并不知道那些蛋白结合磷脂⁽²⁰⁾。

5类PI脂质体和一缺乏PI的脂质体被用于蛋白质芯片检测。每一种都含有磷脂酰胆碱（PC）和1%的生物素标记的DHPE；生物素标记的磷脂可用作检测Cy3标记的抗生蛋白链菌素蛋白。除了PC外其它5种脂质体包含5%的PI（3）P,PI（4) P，PI（3，4）P2，PI（4，5）P2或PI（3，4，5）P3中的一种（图2A）。酵母中含除PI（3，4，5）P3外的这些磷脂⁽²⁰⁾。

这6个脂质体共鉴定出150种不同的蛋白质靶，它们产生的信号明显高于背景；有一个公式可用于帮助鉴定阳性信号⁽²²⁾。52个属于未知蛋白（占35%），余下的98个已知蛋白中45个是于膜有关的或是估计具有跨膜区^(23,24)。这包括完整的膜蛋白，具有磷脂的修饰（如GPI锚蛋白Tos6p和Sps2p，异戊二烯化蛋白Gpa2p和对应的信息素因子）以及于外周相关蛋白（如Kcc4p和Myo4p都位于细胞周边上）^(15，26)。其它8个和磷脂代谢或肌糖磷酸化或是与膜和磷脂功能有关。在52个未知蛋白中，13个（占25%）被认为与膜或其它和基本延伸有关，可能与带阴性电荷的磷脂的静电发生作用。另人惊奇的是磷脂结合蛋白中有19个是激酶，其中17个是蛋白激酶。

磷脂结合蛋白的强弱分类是与GST的量有关（图3）⁽²²⁾。我们发现结合强的蛋白中已知的比例（72%）比结合弱的（54%）要高。更多的强结合蛋白与膜有关（图3）有趣的是17个蛋白激酶中有13个强烈的结合PI。我们进一步根据它们是否偏好一种或是结合PI比PC更强来分类。99个蛋白与PI和PC的结合差不多（PI/PC<1.3）（图3，B和D），然而，49个蛋白只结合或是明显偏好PI（PI/PC>1.3）（图3，A和C）。分析这些PI强结合蛋白，发现它们许多是特异的结合专门PI。例如，Stp22p是细胞质膜蛋白如Ste2p和Can1的空泡标靶所必须的， 偏好于PPI(4)P⁽²⁷⁾。9个蛋白激酶专门的强烈的结合于PI（4）P和PI（3，4）P，1个与这些脂质体有弱的结合。Atp1p是线粒体内膜的F1-ATP合成酶的一亚单位，也结合PI（3，4）P2⁽²⁸⁾。Sps2p位于原孢子膜上，偏好与PI（3）P结合。Myo4p对PI(4,5)P2的偏好结合是非常重要的，因为它们的结合发生在细胞表层，和/或它们的调控。没有发现与PI（3，4，5）P3特异性结合的磷脂，尽管有的蛋白与二者都能结合（图3）。这些结果证明在体内，许多膜蛋白包括完整的膜蛋白和外周蛋白偏好与特异的磷脂结合。

一些与糖代谢有关的蛋白也发现与磷脂结合。这包括：1）依次在糖酵解中有关的三种酶，磷酸甘油酸变位酶，烯醇化酶，丙酮酸激酶；2）巳糖激酶；3）两个蛋白激酶。尽管没有预期过，但先前的研究表明它们可能与磷脂作用。Hxk1p结合刺激它活性的两性离子团，Eno2p的分泌表明与膜有相互作用⁽³¹⁾。我们推测磷脂控制糖代谢过程或在膜表面发生的过程。在后面的例子中，磷脂将作为糖酵解过程的有效平台。

对6个预计与膜功能或脂质体信号无关的蛋白，Rim15p, Eno2p, Hxk1p. Sps1p, Yg1059wp和Gcn2p用两种标准的方法做PI结合的进一步研究⁽³⁰⁾。为了此3蛋白，Rim15p, Eno2p 和Hxk1p, PI(4,5)P2脂质体首次被粘附于硝酸纤维素膜上；不同量的GST蛋白和GST对照被用于检测膜，使用抗GST抗体来检测结合蛋白。如图4A所示，每一种酵母蛋白都结合于PI（4，5）P2，而单独的GST就不结合。我们也做了反向的实验。不同量的这些蛋白被点到硝酸纤维素膜上用6种不同的脂质体检测（图4B）；结合的脂质体用辣根过氧化物标记的抗生蛋白链菌素来检测。在芯片上，脂质体结合到每一个蛋白上，但是不结合到BSA对照上。Sps1p可等量的结合到5种脂质体上。Rim15p,Gcn2p和Yg1059wp对不同的脂质体显示了不同的结合力。PI（3）P，PI（4）P和PI（3，4）P2的结合最强。在每种情况下，蛋白质的量和信号都成线形关系⁽¹⁰⁾。简而言之，这些用蛋白质芯片检测出的PI结合蛋白在用传统方法上同样可以结合脂质。

对于我们实验来说，因为蛋白质都是从酵母中纯化来的，我们可以通过相关蛋白来间接测定。我们检测出的大部分相互作用的蛋白都被认为直接或紧密的与目的蛋白相关，而且蛋白的制备是非常严格，但7个污染的条带用考马丝蓝并未检出关。另一个缺陷是在我们的收集物中代表细胞外区域正确折叠的和分泌蛋白不足，因为GST和HisX6尾都融合与N端。这样，具有信号肽的蛋白就可能不被正确地传递到分泌通道和折叠及修饰，尽管我们检测到3个具有信号肽的蛋白，表明至少一些能正确的产生并包含功能区。另外一个不足是并不是所有的作用都可被检测到，因为并不是所有蛋白在这种高产方法下都能过量分泌和纯化；我们希望80%的点样酵母蛋白都是全长和在可检测水平上的。

不管如何，使用蛋白质芯片比现存的方法具有显著的优势。随机表达文库是不完全的，克隆经常是非全长的，文库的筛选是很乏味的，新的另外一种方法是制成限定性芯片，应用集中的策略来筛选。集中策略需要两个步骤，筛选的蛋白的确切数目是不知道的，当存在的蛋白反应数过多时效果是不好的。因为每一个集合都是阳性的。另外一种检测相互作用的方法是双杂交法⁽²⁾。在这种方法中，作用通常在细胞核中检测，这就限制了可被检测的种类。蛋白质芯片的优势在于一系列高密度的蛋白能够在体外的宽广条件下，直接检测许多活性包括蛋白质-药物、蛋白质-脂类和酶活测定。不仅如此，一旦蛋白质制备好，蛋白组的筛选是非常迅速和便宜的。使用类似的方法，就可以准备10-100，000蛋白的芯片对人类和其它真核生物的蛋白质组进行分析。


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32. We thank K. Nelson and S. Dellaporta for providing invaluable help. We also thank A. Kumar, G. Michaud, and C. Costigan for providing comments on the manuscripts. This research is supported by grants from NIH. H. Z. and R. J. were supported by a postdoctoral fellowship from the Damon Runyon-Walter Winchell Foundation and by an IBM Graduate Research Fellowship, respectively.

2 May 2001; accepted 13 July 2001
Published online 26 July 2001;10.1126/Science.1062191