双向电泳IPG
一、样品提取：三氯醋酸—丙酮沉淀法
（1） 在液氮中研磨叶片
（2） 加入样品体积3倍的提取液在-20℃的条件下过夜，然后离心（4℃8000rpm以上1小时）弃上清。
（3） 加入等体积的冰浴丙酮（含0.07%的β-巯基乙醇），摇匀后离心（4℃8000rpm以上1小时），然后真空干燥沉淀，备用。
（4） 上样前加入裂解液，室温放置30分钟，使蛋白充分溶于裂解液中，然后离心（15℃8000rpm以上1小时或更长时间以没有沉淀为标准），可临时保存在4℃待用。
（5） 用Brandford法定量蛋白，然后可分装放入-80℃备用。
二、一向电泳（13cm的holder）
（1） 取大约70-100ng的蛋白与溶胀液混合总体积达到250vl
（2） 将上述溶液加到holder的两个电极之间。
（3） 去掉胶条的保护膜，胶面朝下，先将胶条尖端朝胶条槽的尖端方向放入胶条槽中，慢慢下压胶条，并前后移动，避免生成气泡，最后放下胶条平端，使溶液浸湿整个胶条。
（4） 在胶条上覆盖适量的覆盖油，盖上盖子。
（5） 将胶条槽平放于一向仪器上，与水平方向垂直。
（6） 设置仪器的运行参数：
三、胶条的平衡（由一向到二向）
（1） 将胶条放入10ml平衡缓冲液中（加入10mgDTT）封口，在振荡仪上振荡15分钟。
（2） 将胶条取出放入10ml新的平衡缓冲液中（加入250mg的碘乙酰胺）封口，在振荡仪上振荡15分钟。
（3） 用去离子水润洗胶条一秒钟，将胶条的边缘置于滤纸上几分钟，以去除多余的平衡缓冲液。
四、二向电泳
（1） 将平衡好的胶条直接转移到第二向制好的SDS胶上，然后用琼脂糖封顶，准备第二向电泳.
（2） 设置仪器的运行参数：
五、平板胶的染色
硝酸银染色：（整个操作在摇床上进行）
（1） 固定：25ml的冰醋酸，100ml甲醇，125ml去离子水，60分钟。
（2） 敏化：75ml甲醇，0.5g硫代硫酸钠（使用之前加入），17g醋酸钠，165ml去离子水，30分钟。
（3） 清洗：用250ml的去离子水清洗3次每次5分钟。
（4） 银染：0.625g硝酸银，250去离子水，（使用之前配制）20分钟。
（5） 显色：6.25g碳酸钠，100vl的甲醛（使用之前加入），250ml去离子水。
（6） 终止：5%的醋酸。
（7） 照相分析。
（8） 保存制作干胶。
药品：
提取液：含10%TCA和0.07%的β-巯基乙醇的丙酮
裂解液：2.7g尿素0.2gCHAPS溶于3ml灭菌的去离子水中（终体积为5ml），使用前再加入1M的DTT65ul/ml。
平衡缓冲液：1.5MTris－Cl ph8.8 6.7ml，尿素72.07g ，87％的甘油69ml，SDS 4g，溴酚蓝少许。
溶涨液：尿素12g，CHAPS0.5g，溴酚蓝少许溶于无菌水中，总体积为25ml。使用之前再加入IPG缓冲液0.5vl/100vl，DTT1.5vl/100vl。
制作平板胶：
分离胶的配制方法：
|
药品/浓度 |
5％ |
7.5％ |
10％ |
12.5% |
15% |
|
丙烯酰胺 |
6.7ml |
10ml |
13.3ml |
16.7ml |
20ml |
|
分离胶缓冲液 |
10ml |
10ml |
10ml |
10ml |
10ml |
|
10×SDS |
0.4ml |
0.4ml |
0.4ml |
0.4ml |
0.4ml |
|
无菌水 |
22.7ml |
19.4ml |
16.1ml |
12.8ml |
9.5ml |
|
10％过硫酸胺* |
200vl |
200vl |
200vl |
200vl |
200vl |
|
TEMED* |
13.3vl |
13.3vl |
13.3vl |
13.3vl |
13.3vl |
*在灌胶之前加入
药品配制：
丙烯酰胺单体储液：丙烯酰胺60g甲叉双丙烯酰胺1.6g溶于无菌水中总体积200ml
分离胶缓冲液：Trisbase181.5g溶于750ml无菌水中调PH8.8总体积1000ml
10％SDS：SDS5g溶于无菌水中总体积50ml
10％的过硫酸胺：0.1g溶于无菌水中总体积1ml
SDS电泳缓冲液：Trisbase15.1g甘胺酸72.1gSDS5g溶于无菌水中总体积5000ml
封胶溶液：SDS电泳缓冲液100ml琼脂糖0.5g溴酚蓝少许
附：蛋白质含量测定的方法（Bradford方法）
原理：这一方法基于2考马斯亮蓝G－250有红蓝两种不同的形式。在一定浓度的乙醇及酸性条件下，可配成淡红色的溶液，当与蛋白质结合后，产生蓝色化合物，反应迅速而稳定。反应化合物在465－595nm处有最大的光吸收值，化合物颜色的深浅与蛋白浓度的高低成正比关系，因此可检测595nm的光吸收值的大小计算蛋白的含量。
溶液：
1）Bradford储存液
100ml95％乙醇
200ml88％磷酸
350mgServaG蓝
室温下长期保持稳定。
2）Bradford工作液
425ml双蒸水
15ml95％乙醇
30ml88％磷酸
30ml Bradford储存液
用滤纸过滤，保存于室温棕色瓶中，可保存数周，但在使用前需要过滤。
3）配制1mg/ml牛血清蛋白（BSA）
做标准曲线：
|
样品号 |
蛋白量 /vg |
标准溶液 1mg/mlBSA/vl |
实验缓冲液 /vl |
Bradford试剂/ml |
A595 |
|
1 |
0 |
0 |
100 |
3 |
0 |
|
2 |
2.5 |
2.5 |
97.5 |
3 |
0.120 |
|
3 |
2.5 |
2.5 |
97.5 |
3 |
0.130 |
|
4 |
5 |
5 |
95 |
3 |
0.250 |
|
5 |
5 |
5 |
95 |
3 |
0.215 |
|
6 |
7.5 |
7.5 |
92.5 |
3 |
0.331 |
|
7 |
7.5 |
7.5 |
92.5 |
3 |
0.364 |
|
8 |
10 |
10 |
90 |
3 |
0.460 |
|
9 |
10 |
10 |
90 |
3 |
0.442 |
|
10 |
12.5 |
12.5 |
87.5 |
3 |
0.531 |
|
11 |
12.5 |
12.5 |
87.5 |
3 |
0.562 |
|
12 |
15 |
15 |
85 |
3 |
0.633 |
|
13 |
15 |
15 |
85 |
3 |
0.617 |
|
14 |
17.5 |
17.5 |
82.5 |
3 |
0.684 |
|
15 |
17.5 |
17.5 |
82.5 |
3 |
0.650 |
|
16 |
20 |
20 |
80 |
3 |
0.721 |
|
17 |
20 |
20 |
80 |
3 |
0.727 |
取样品即可测量。
注意事项：
1、样品的问题：
样品制备是做好2-d的关键，这句话好象有点多余，如果样品中离子浓度过大，根本做不了2d，我开始的时候由于提取方法有问题，结果浪费了很多时间和IPG胶条，真的很心痛呀！另外再说明一点，最好用新鲜的样品提取蛋白质，蛋白点的差异很大，新鲜的样品点多，而我用存放在-80的样品跑出来效果差了很多呀！如果你不确定你的蛋白提的如何，建议你先跑sds-page。检验一下。关于蛋白的提取方法，我还想听听各位的建议。
2、上样量的问题，我觉得我跑的这张2D图，上样量还需要调整，可以适当降低，我的