六、制备探针
分离RNA：我们成功尝试了各种方法制备的RNA，包括热酚抽提、异硫氰酸胍稳定及其它方法等，这些方法已在别处综述过，就不在此赘述了。我们也成功尝试了Invitrogen的FastTrak 2.0 mRNA isolation kits (Invitrogen K1593-02)，用于抽提人和酵母的样品。主要判定指标为产出高质量的RNA。对基因表达研究来说，最好的结果是用poly-dA RNA作为逆转录模板，尽管，至少对酵母菌来说，用总RNA作为逆转录模板也取得了好结果。一个好实验对每种标本需要至少1µg(越多越好)polyA RNA(或100µg总RNA)以用作合成荧光标记cDNA探针的模板。扩增小量RNA的方法正在尝试之中， 与在这讨论的方法进行比较。
标记：已有许多方法用于从RNA制备标记探针。在多数情况下，我们直接在oligo-dT为引物进行逆转录反应时标记cDNA。在某些条件下，用随机引物进行cDNA合成也可用于标记，尽管此方法不是对所有微阵列设计都适用。例如，由3’端序列组成的微阵列更适用于oligo-dT反转录的cDNA探针，由完整cDNA序列或含预测开放阅读框架序列构成的微阵列对两种逆转录方法都适用。样品还可在未标记的第一链合成后进行第二链合成时再标记。以下列出三种方法。
荧光染料：很多荧光染料标记的双脱氧核苷酸可由商业渠道取得。出色的结果是用Cy3-和Cy5-dUTP获得，两者激发光谱分得很开，用多种酶均可获得特异活性掺入，干燥后就可激发荧光，从而简化了图象获取过程。我们取得良好结果的其它荧光染料包括R110 (Perkin Elmer)、TAMRA (Perkin Elmer)和SpectrumOrange(Vysis)。
oligo-dT和随机引物逆转录标记：所有试剂应经过灭菌及DEPC处理。RNA溶于10µl水中，该溶液应包括一些对照RNA(参见本文后半部分)。加2.5µl(6µg)引物(20-mer oligo-dT，anchored oligo-dT，random hexamer或random nonamer：2.5µg/µl，用水配制)。70°C水浴10分钟以变性RNA，放于冰上。将下列试剂混合：2µl MMLV逆转录酶(GibcoBRL SuperScriptII Rnase H- Reverse Transcriptase kit; 目录号 18064-014)，6µl 5×first-strand buffer (SuperScript kit; 250mM Tris-HCl， pH 8.3， 375 mM KCl， 15 mM MgCl2)， 3µl 0.1 M DTT(也在试剂盒中)， 6µl 5×nucleotides (2.5 mM dATP，2.5 mM dCTP，2.5 mM dGTP，1.0 mM dTTP)，3µl 1mM Cy3或Cy5标记的dUTPs (Amersham)。上述混合液加入RNA-引物溶液，终体积为30µl，42°C保温1小时。加入1µl SuperScript II逆转录酶，42°C再保温1小时。加1.5µl 20mM EDTA以终止反应，加入15µl 0.1M NaOH降解模板RNA，70°C孵育10分钟，立即加入15µl 0.1M HCL以中和样品(荧光染料，尤其是Cy5对高PH敏感)。将样品放入Microcon30微浓缩器(Amicon)，并加入500µl TE (10 mM Tris，pH 8.0，1 mM EDTA)，在台式离心机上高速离心5-10分钟，以调整体积至10-20µl，弃流出液，加500µl TE，再次离心。二次离心后，Microcon滞存的探针应显著比流出液清亮。这一个成功标记反应的非常有力的指示现象。如果没有一点颜色滞存，标记反应就不太可能产生好的染交结果。将离心柱反转，再离心1分钟，以收集探针，将Cy3、Cy5标记的探针混合，并TE调整体积至500µl，用离心柱调整体积至8µl(到此，颜色应显紫色)。加2µl封闭液，封闭液含10g/µl 20-mer oligo-dA，10µg /µl yeast tRNA以及10µg/µl human cot-1 DNA (用于人探针时，GibcoBRL目录号15279-011)。加入2.1µl 20×SSC(终浓度为3.5×)和0.4µl 10%SDS(终浓度为0.3%)。注意加SDS时，枪头外壁不应有SDS，因为过多SDS会对杂交反应产生负影响。将样品放入100°C水浴1分钟，以变性样品。该样品应在实验台上自然冷却。对人样品，应在室温下放置30分钟，以允许cot-1酶切DNA片段与重复序列杂交，对酵母样品来说，样品一旦冷却下来即可用于杂交反应了。对杂交面积为2cm×2cm的阵列来说，杂交液体积适宜用12µl，杂交面积越大，也就需要更大体积的杂交液。
用Klenow酶标记cDNA：用以上方法制备cDNA模板，唯一例外之处是5×核苷酸溶液中的每种dNTP浓度为2.5mM(即逆转录反应中每种dNTP的终浓度均为0.5mM)，不含荧光染料标记的核苷酸。按前述方法调节样品至终体积20µl，加入3µl随机引物(hexamer或nonamer，4µg/µl)，100°C变性1分钟，置实验台上冷却5分钟。加入5µl 10× buffer (100mM Tris-HCl， pH 7.4， 50 mM MgCl2， 75 mM DTT)， 5µl 10× nucleotides (0.25 mM dATP，0.25 mM dCTP，0.25 mM cGTP，0.09 mM dTTP)，1.5µl 1mM Cy3或Cy5 dUTP(Amersham)，2µl(10U)无外切酶活性的Klenow酶(USB，目录号E700572)，13.5µl ddH2O至终体积50µl。37°C温育4小时。按前述方法纯化样品并准备杂交。
七、杂交
用台式离心机将探针样品高速离心1分钟，以沉淀任何可能的杂质。用移液枪将样品吸加到阵列中央，注意不要碰到离心管中任何沉淀并避免形成气泡。封盖玻片(要足够大以覆盖整个阵列杂交区表面)，注意不要形成气泡。在该玻片的另一区域滴加5µl 3×SSC，以提供杂交舱内湿度，由此可以确保杂交过程中探针混合物不会蒸干。将玻片放入封口的杂交舱中，并浸入65°C水浴，4-6小时。
八、杂交后处理
杂交后，小心擦干杂交舱并移出玻片，浸入盛有洗液1(2×SSC，0.1%SDS)的玻片槽中，玻片点样面朝下，这样当盖玻片掉落时不会划伤阵列表面。剥落盖玻片后，将玻片在洗液中晃动2-3次后移入盛有洗液2(1×SSC)的玻片槽中，小心操作，尽可能减少洗液1混入玻片槽2中，因为SDS会干扰玻片图象质量。轻柔摇晃玻片槽2分钟，将玻片移入盛有洗液3(0.2×SSC)2分钟，然后离心甩干玻片。所有洗液温度均应为室温。改变这些步骤的温度和时间会改变杂交的严谨性。
九、参照
由于微阵列试验的高平行性，所以在每张阵列反应中加入多种参照物是可能的而且是很有价值的。下面将描述一些有用的参照。
掺入RNA：在探针制备过程的各个阶段加入已知量的参照RNA，对检测和评价每次实验的各个方面是非常有用的。很明显，选用的掺入RNA不应与待研究的有机体的RNA有交叉杂交，但两者总体特性应相近(GC含量、长度、poly-A尾巴)。许多酵母菌基因可以在人基因表达阵列上用作参照，因为两者在核苷酸水平的同源性很有限。将上百个这样的基因点于人的基因阵列上只是显著增加了点样时间。将这些基因克隆到带有噬菌体RNA聚合酶结合位点和人造poly-A尾巴的质粒上，就可以制备用于各个实验阶段的参照基因的大量RNA。此类参照可用于各个方面，例如，参照RNA可以按不同比例或以不同总浓度掺入Cy3、Cy5标记反应，由此可以测定杂交严谨性、输入比和输出比的校正以及检测灵敏度。
RNA质量参照：某一类型核酸与互补靶基因结合的量与互补序列长度有关。所以某一给定cDNA的杂交信号强度随RNA质量好坏而不同。这会导致不能理解的微阵列杂交结果，例如，用不同质量的同一RNA衍生得到的等量cDNA用于杂交时，会看到ratio值明显不相同。谨慎选择靶基因序列可使这个问题的影响最小化。对oligo-dT逆转录的cDNA，如果靶基因序列局限在3’端，则对RNA质量最不敏感。RNA质量可由相应参照物方便地检测，例如叠瓦式覆盖整个基因的长度为100-200bp的一组DNA片段可以用于测定待比较样品中的RNA相对质量，而降解RNA及由oligo-dT逆转录标记的cDNA于5’序列含量较多的基因杂交会产生相应比例的弱信号。制备叠瓦式基因片段作为参照，在RNA和探针制备的各个阶段掺入进去，例如，收获细胞时、分离poly-A RNA时、探针标记时以及杂交前，由此可以鉴定设计RNA质量问题的实验步骤。
封闭参照：如前所述，由于探针和靶基因之间存在非基因特异性的相似性，尤其是由重复序列引致的，大多数杂交反应需加入冷DNA进行封闭。与此类潜在的混淆序列相应的参照靶基因可用于检测封闭是否成功。例如，如果重复序列被成功封闭，在人类基因表达阵列上含有人cot-1酶切DNA片段的基因点应产生极弱或甚至阴性信号。其它有用的阴性参照包括oligo-dA、oligo-dT、质粒DNA和人基因组DNA。
归一化参照：对多个样品来说，很难准确制备完全等量的参照mRNA标记探针，所以加入一些预期在相互比较的2个样品中的杂交信号一致的参照基因是非常有用的。例如，对酵母菌表达实验来说，酵母菌总基因组DNA制备的靶基因可用于校正两样品间的信号，而人基因表达实验的校正更复杂，由于只有一小部分基因组是表达的，人总基因组DNA杂交信号应该非常低。
