恶性疟原虫荧光定量聚合酶链反应检测方法的建立

江晓玲（510515 广州市，第一军医大学热带病研究室）；李明（510515 广州市，第一军医大学热带病研究室）；徐伟文（510515 广州市，第一军医大学热带病研究室）；毕惠祥（510515 广州市，第一军医大学热带病研究室）；程钢（中山医科大学达安基因公司）；李虎（中山医科大学达安基因公司）；诸欣平（首都医科大学）

关键词: 疟原虫；恶性；基因；结构；原虫；聚合酶链反应
【摘要】目的　建立恶性疟原虫荧光定量聚合酶链反应（PCR）检测方法，为快速、准确地定量检测恶性疟原虫奠定基础。方法　根据恶性疟原虫SSUrRNA基因序列，设计并合成引物和荧光标记探针。将PCR扩增的恶性疟原虫SSUrRNA片段克隆入载体，重组质粒经筛选、鉴定后， 作为阳性模板，用于标准曲线的制定和样品检测。结果　应用重组质粒制作的定量曲线循环阈值与模板浓度具有良好的线性关系，相关系数为0.998。检测恶性疟血样26份、间日疟血样20份及混合感染血样5份均阳性；正常血样36份均阴性。结论　建立了检测恶性疟原虫的荧光定量PCR方法，较常规PCR技术更为简便、快速、准确，有很好的应用前景和研究价值。
Fluorogenic quantitative PCR method for detecting plasmodium falciparum.
JIANG Xiaoling
Institute of Tropical Medicine
LI Ming, XU Weiwen, et al.
First Military Medical University, Guangzhou 510515, China
【Abstract】Objective　To establish fluorogenic quantitative PCR method for detecting Plasmodium falciparum.Method　According to the specific sequence of Plasmodium falciparum SSUrRNA genes, the primers and the fluorogenic probe were designed and synthesized. The fragment generated from SSUrRNA as template was cloned into the T vector which was constructed from the pBluescript plasmid. The positive recombinant plasmid would be used as standard quantitative template to make the standard curve for sample detection.Results　The standard curve indicated the linear relationship between CT(cycle threshold) and template concentration. The detection of 87 cases of P.f, Pv and normal blood samples proved the advantage of this method.Conclusion　The fluorogenic Quantitative PCR method for the detection of Plasmodium falciparum is simple and accurate.
【Key words】Plasmodium falciparum;Genes, structural, protozoan;　Polymerase chain reaction
　　聚合酶链式反应（PCR）技术应用于疟原虫的诊断，其敏感性、稳定性是以往其他检测技术无法比拟的。但存在的主要问题是基因高效扩增造成扩增产物污染而导致假阳性；不能进行基因定量检测［1］。1995年出现的以标记特异性荧光探针为特点的荧光定量PCR技术，实行完全闭管式操作，能大大减少扩增产物污染的机会，提高检测的特异性，并可通过电脑自动读数对扩增产物进行精确定量［2,3］，将此技术用于疟原虫的检测，无疑会有很高的研究和实用价值。我们在常规PCR技术的基础上，建立了检测恶性疟原虫的荧光定量PCR方法。
材料与方法
　　一、材料
　　1.标本来源：恶性疟阳性血样26份、间日疟阳性血样20份、混合感染血样5份采自云南，非疟区健康献血员血样36份采自本校附属南方医院，恶性疟原虫FCC-1/HN株DNA由本室提供。
　　2.仪器试剂：PE 9600 型常规PCR扩增仪、ABI PRISM 7700 型荧光定量PCR扩增仪、荧光发光基团(FAM)、荧光淬灭基团(TETRA)购自美国PE公司。QIAEXII纯化试剂盒购自QIAGEN公司。
　　二、方法
　　1.血样采集及模板DNA制备：耳垂或手指采血，肝素抗凝，-20℃保存。转送至实验室后，每份样品取20 μl用STE缓冲液洗涤两次，离心后弃上清液，加100 μl DNA提取液(0.5 mol/L EDTA, 2%SDS, 2 mol/L NaOH)煮沸10 min，离心后上清液即可用于PCR扩增。
　　2.引物及探针的设计与合成：根据恶性疟原虫SSUrRNA基因序列，分析比较其他人类疟原虫（间日疟原虫、三日疟原虫）和人SSUrRNA基因相应序列，用PCGENE软件设计引物， 上、下游引物序列分别为恶性疟原虫种特异的SSUrRNA编码区第665～688位碱基序列和947～970位碱基序列［4,5］，扩增片断长度为205 bp；根据扩增的SSUrRNA片断序列设计恶性疟原虫特异探针，并按荧光定量PCR探针要求进行标记，其5′端标记FAM，3′端标记TET。
　　3.靶基因的扩增及纯化：(1)常规PCR反应：反应总体积50 μl，反应条件为 93℃ 45 s，58℃ 45 s，72℃ 1 min，末次反应于72℃保温10 min，共35个循环 ， 产物经2％琼脂糖凝胶电泳，割胶后纯化扩增片段。
　　4.PCR扩增产物的克隆：(1)重组质粒的构建：用pBluScript质粒构建T载体［6,7］，将纯化后的扩增产物测A值定量后，按与载体摩尔数之比(3∶1)的比例在T4连接酶作用下进行连接反应，构建扩增产物的重组质粒。(2)重组质粒的筛选：将重组质粒转化入JM109感受态细胞内， 进行蓝白斑筛选，提取质粒DNA，1％琼脂糖凝胶电泳筛选重组质粒。然后以PCR鉴定阳性重组子。
　　5.阳性定量标准曲线的建立：将鉴定好的质粒，测A值，计算出拷贝数，稀释成108、107、106、105、104、103、102、101拷贝数/μl浓度梯度，加入50 μl反应体系，在ABI PRISM 7700扩增仪上进行扩增，反应条件为 93℃45 s，55℃2 min，共40个循环。反应结束后在计算机上得到标准曲线。
　　6.样品的检测：将样品分别在PE 9600和ABI PRISM PE 7700上进行扩增，观察、记录试验结果。
结果
　　1.常规PCR扩增产物的鉴定:以恶性疟原虫克隆株DNA经PCR扩增，产物用2％琼脂糖凝胶电泳，得一大约200 bp与目的片段大小一致的电泳条带。
　　2.重组质粒的筛选：PCR扩增产物连接入T载体所构建的重组质粒，经蓝白斑LB平板筛选，获得大量克隆，挑选显白色的克隆株，用含氨苄青霉素LB培养基培养，碱裂解法抽提质粒，1％琼脂糖凝胶电泳可见3、8号管质粒略大于空载体，说明有外源基因的插入（图1）。

M：DNA分子量标准，0：空载体，1～10：随机挑选质粒
图1　重组质粒琼脂糖凝胶电泳鉴定结果
　　将上述各管质粒稀释50倍，进行PCR扩增后，2％琼脂糖凝胶电泳, 以上述PCR扩增产物为阳性对照。可见3、8号出现一条与阳性对照片段大小一致的条带，说明了所插入的外源基因为目的基因片段。
　　3.定量标准曲线的建立：将重组质粒测A值定量后，稀释成108、107、106、105、104、103、102、101拷贝数/μl浓度梯度，在PE 7700型扩增仪上进行扩增反应。 该仪器能在PCR反应进行的过程中，每8 s实时检测一次产物量，反应结束后，给出PCR扩增的动力学曲线。图2所示，起始模板数为107～102拷贝/μl扩增反应的动力学曲线（图2）。

1～6动力曲线，模板拷贝数分别为107～102拷贝/μl
图2　荧光PCR扩增的动力学曲线图
　　由图2可见，不同起始浓度的模板，在反应后平台期产物量相差不大。因此，将检测定在产物大量生成初期，即刚进入指数增长期的起始点位置--循环阈值（CT），经对数拟合做图，得到定量标准曲线，起始模板浓度与CT值之间呈良好的线性关系。
　　4.样品的检测结果：26份镜检恶性疟阳性血样与5份混合感染血样，PE 9600、ABI PRISM 7700检测均为阳性，20份镜检间日疟阳性血样，PE 9600检测有2份为恶性疟原虫阳性，ABI PRISM 7700检测除这2份外（拷贝数分别3.8 ×102拷贝/μl，8.9×102拷贝/μl），还有1份是恶性疟原虫阳性（3.2×102拷贝/μl）。经多名熟练镜检员镜检观察，上述3份证实为恶性疟原虫的混合感染。36份正常血样两种方法检测结果均为阴性。
讨论
　　疟疾是严重危害人类健康的寄生虫病之一，疟疾的防治仍是当前我们所面临的一大重要课题。随着对疟疾防治研究的深入，迫切需要建立一种既能防污染又能简便、快速定量检测疟原虫的方法，以准确检测疟原虫，更好地研究疟原虫的感染程度与疟疾发生、发展的关系，并进行抗疟治疗的监控，为新药和疟疾疫苗的研制和评价提供客观、可信的量化资料。而荧光定量PCR技术的出现，为进行这方面的研究提供了新的思路。
　　荧光定量PCR技术巧妙地利用了PCR技术的DNA高效扩增、探针技术高特异性和光谱技术的敏感性及定量分析的优点，克服了常规PCR定性检测的一些不足， 极大地提高了检测的敏感性和特异性。荧光探针经去羟基化处理，不会在Taq酶作用下发生延伸。它只有与待测模板完全匹配的结合，才会发生荧光报告基团的切割，产生荧光的消长，因而由于引物的非特异性扩增而导致的假阳性问题能够得以解决。由于其活性和稳定性通常在45℃～65℃之间保持最佳状态，故采用双温法进行扩增定量。荧光检测的结果由电脑分析读数，避免了产物后处理过程所致的污染，较常规PCR更为客观、灵敏、准确。但样品处理过程中的交叉污染仍然存在［8-10］。
　　由定量标准曲线图可以看出，不同梯度定量模板数的对数值与CT值之间有较好的相关关系，其相关系数为0.998 。模板数不同，其CT值也不同，模板数越少CT值越大。在最佳反应条件下，1个拷贝的起始模板数其CT值约为37～40 100个拷贝CT值约为30.5， 因此，反应循环数定为40，可满足最低检测线的要求。本试验的检测阈值为100个拷贝。
　　本研究沿用以往PCR的工作经验， 根据疟原虫SSUrRNA基因具有属、种特异性，并且具有序列高度的保守性的特点，扩增恶性疟原虫种SSUrRNA特定基因片段， 并加以荧光探针进行定量。 由87份样品的检测结果可以看出，镜检为恶性疟和混合感染的血样，荧光定量检测结果均为阳性；健康献血员的血样，荧光定量检测结果均为阴性；值得争议的是20份镜检为间日疟血样中的3份用此法检测结果是恶性疟阳性的血样，经严格控制试验条件，排除了样品交叉污染的可能性，又经镜检员仔细镜检观察，证实有恶性疟原虫混合感染。由此说明，在本试验中，荧光定量PCR方法的灵敏度高于镜检法和常规PCR法，与现有的灵敏度较高的套式PCR扩增技术相比较，此法操作更为简便、快速。因此，荧光定量PCR技术有很好的应用前景和研究价值。
基金项目：全军医药卫生科研基金课题（96L034）
参考文献
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