“长江学者”陈林小组成功构建RNAi转基因小鼠模型

生物谷

    动物模型是研究人员了解生物体发育、病理机制以及药物研制等方面的一种强有力的工具。来自第三军医大学的“长江学者”李林教授的研究组成功构建了RNAi转基因小鼠模型。

    为了研究骨形成蛋白4(Bone morphogenetic protein 4, BMP4)在骨骼发育中的作用，研究组以含有pLoxPneo基因的pBSK/U6载体为骨架，首先构建小鼠BMP4条件性RNAi(conditional RNA interference)载体――BMP4CRNAi，然后利用限制性内切酶Kpn I和Afl III获取目的干扰片段并利用纯化后的含neo基因的片段对FVB小鼠超排获取的0.5天的受精卵进行显微注射。

    研究组利用PCR对G0代小鼠进行鉴定筛选，PCR阳性小鼠再与FVB小鼠交配，获取稳定传代的BMP4CRNAi小鼠；稳定传代的BMP4CRNAi小鼠与Col2a1-cre转基因小鼠交配，获取BMP4 Col2a1-CRNAi小鼠，分离BMP4 Col2a1-CRNAi小鼠原代软骨细胞，提取总RNA，利用半定量RT-PCR检测干扰效率。
通过PCR筛选和测序验证结果表明：成功构建BMP4条件性敲低载体；PCR和RT－PCR结果表明：成功获得条件性RNAi转基因小鼠以及在软骨细胞中敲低BMP4的小鼠，敲低效率为81％。这些结果表明，他们成功制备出了BMP4CRNAi小鼠和BMP4 Col2a1-CRNAi小鼠。这种小鼠模型的建立，为研究BMP4在不同组织细胞的功能奠定了基础，并且也为研究BMP4在软骨发育中的作用提供了合适的动物模型。

    另外，陈林教授率领的研究组还建立成功了条件性缺氧诱导因子－1α RNAi转基因小鼠模型。

    缺氧诱导因子1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）是细胞在缺氧等条件下稳定表达的具有转录活性的蛋白，通过与多种靶基因调控区的缺氧反应元件（hypoxia response element，HRE）结合,调控靶基因表达,使机体对缺氧、缺血等病理生理过程产生适应性反应。

    研究人员指出，为了从整体动物水平研究HIF-1α的作用，就需要建立HIF-1α相关遗传修饰小鼠。

    因此，他们分别针对HIF-1α mRNA序列的两个靶位点合成两对互补的寡核苷酸链，构建可诱导的RNA干扰真核表达载体HIF-AB和HIF-CD。分别将CRE重组酶真核表达载体CRE-ERT2与HIF-AB或HIF-CD转染入RAW264.7细胞，筛选得到稳定表达CRE-ERT2与HIF-AB，或CRE-ERT2与HIF-CD的稳定细胞系。

    在用4-HT诱导去除上述细胞系中HIF-AB或HIF-CD所含的Neo基因后，用CoCl2诱导HIF-1α表达，采用半定量RT-PCR检测HIF-AB或HIF-CD对HIF-1α 基因表达的影响。

    结果发现干扰载体（HIF-AB和HIF-CD）对HIF-1α mRNA序列的沉默效果分别为85%和72%。选择干扰效率较高的表达载体HIF-AB经显微注射获得HIF-1α基因敲低小鼠模型，经PCR以及测序验证已获得2个转基因阳性小鼠（Founders，G0代）。G0代雄鼠与FVB/N雌鼠交配后获得2只F1代（first filial generation）转基因阳性小鼠，经与EIIA-Cre转基因小鼠交配，得到EIIA-Cre;HIFRNAiflox/+小鼠，RT-PCR结果显示，EIIA-Cre;HIFRNAiflox/+小鼠肝、肺、肾等组织的HIF-1α mRNA水平明显降低，分别约为正常对照的44%、38.2%和23.5%。

    研究人员表示，该小鼠模型的建立为进一步研究HIF-1α的功能及作用机制提供了新的手段。

    陈林，男，第三军医大学教授，受聘为国家教育部第五批“长江学者奖励计划特聘教授”，聘任岗位：外科学野战外科。