AMCase基因突变体克隆成功

生物谷

        日前，第四军医大学西京医院皮肤科陈凌硕士等，在军队“十五”医药卫生科研基金资助下，成功地克隆了小鼠酸性哺乳动物几丁质酶（AMCase）基因突变体，相关生物学学信息的明确，为今后运用分子生物学技术进一步深入研究其作用奠定了基础。

        几丁质又称甲壳质，是大多数真菌细胞壁的主要结构成分。几丁质的催化水解是由几丁质酶完成的，它存在于多种物种体内，现已证明提纯的植物和某些细菌的几丁质酶具有抗真菌活性，可使20多种真菌的芽管解体、菌丝生长受抑制等。酸性哺乳动物几丁质酶（AMCase）是不久前发现的第二种人几丁质酶，其在啮类动物和人身上有一定的同源性，大量存在于胃肠道，小部分存在于肺。序列分析和同源模拟提示，这种几丁质酶可能在消化和防御感染方面具有重要作用。

        为了克隆小鼠AMCase，并进行序列分析，陈凌硕士等从BALB/c小鼠胃组织中提取总RNA，逆转录成cDNA，运用PCR技术体外扩增获得AMCase基因，构建pMD18-T/AMCase重组载体，测序后应用DNAMAN4.0软件与标准序列进行比较，并通过Si-gnalP3.0和TMHMMServer  v.2.0等服务器对等电点、氨基酸组成、信号肽和跨膜结构等特征进行分析。

        结果发现，所克隆的基因共编码473个氨基酸，分子量为51.93kD，等电点为4.73，与AMCase同源性达99.57%，同属18家族的几丁质酶成员，由信号肽（氨基酸1～21）、催化区（氨基酸22～391）、铰链区（氨基酸392～425）和结合区（氨基酸426～473）组成。编码的蛋白质在催化区和铰链区分别发生了突变，292位氨基酸由丙氨酸（Ala）突变为脯氨酸（Pro），404位氨基酸由苏氨酸（Thr）突变为丝氨酸（Ser）。

        据陈凌介绍，从几丁质酶这一大家族来看，为了适应环境（特别是微观环境）的变化，其在生物体进化过程中，会发生与种族无关的微小变异，这说明所克隆的基因为AM鄄Case的一个突变体，这种AMCase突变体的出现，可能是哺乳动物几丁质酶适应微观环境的一种表现，这种变化是否会影响其对几丁质底物的催化，以及其抗真菌作用是否会有所改变，有待于进一步深入研究。