材料与方法
材料 (1)白细胞提取：用Ficoll分离液获取人外周血白细胞，培养基DMEM(含10%FCS)悬浮配成浓度为105个/ml；(2)血管内皮细胞培养：24孔培养板(每孔104个细胞悬液)培养人脐静脉内皮细胞ECV-304。待细胞生长至对数增长期，分组实验；(3)ECV-304人脐静脉内皮细胞(武汉大学动植物保藏中心提供)。鼠抗人ICAM-1单克隆抗体以及SABC-FITC试剂盒购于北京中山公司。SNAP、TNF系sigma公司产品。
方法 实验分组：分5组以观察内皮细胞受刺激后粘附的白细胞数。C组为对照组，不加任何刺激剂。T组每孔加入TNF的刺激浓度为100U/ml。TN组为TNF和NO组，在加入TNF之前，加入新鲜配制的S-亚硝基-N-乙酰青酶胺(SNAP)500μm，以观察NO对TNF诱导粘附的影响。N组只加入新鲜配制的SNAP500μm。待各组刺激达12小时后，每孔加入105个白细胞于37℃共同孵育20分钟。倒置相差显微镜下计数每高倍视野(400×)中粘附到内皮细胞上的白细胞数，并计算占该视野中内皮细胞数的百分数。TA组方法同T组，TNF刺激内皮细胞达12小时后，每孔加入抗粘附分子ICAM-1单抗，与37℃孵育30分后，每孔加入105个白细胞于37℃共同孵育20分钟。以观察抗ICAM-1抗体对TNF诱导粘附的影响。除TA组外其余各组待刺激剂刺激内皮细胞12小时后，每孔取少许细胞104个，离心机固定于载玻片上按常规免疫细胞化学方法来观察内皮细胞膜ICAM-1的表达。
统计学分析 所有指标均以均数±标准差表示。粘附到内皮细胞上的白细胞数变化采用χ2检验，ICAM-1表达采用t检验分析。P＜0.05为显著性差异。
结 果
内皮细胞粘附白细胞数的变化 刺激12小时后C组粘附的白细胞数占整个视野内皮细胞数的百分数为15.79%。T组受TNF刺激，粘附的白细胞数增加为67.47%，同C组比有极显著性差异。N组SNAP刺激内皮细胞粘附的白细胞数16.23%，同C组比无显著性差异。TN组同TA组粘附的白细胞数分别为52.36%和50.51%，同T组比仍具有显著性差异。说明NO和抗ICAM-1单抗阻滞了TNF诱导的粘附。
内皮细胞膜ICAM-1表达 计算机图象分析内皮细胞膜ICAM-1表达的积分光度，可见T组较C组比明显降低(P＜0.01)。虽TN组同C组比，P＜0.01，但同T组比仍具有显著性差异，说明SNAP抑制 TNF诱导的ICAM-1表达。N组同C组比无显著性差异。
讨 论
本实验观察到，受TNF刺激12小时，不仅大量PMN粘附到内皮细胞层上，而且内皮细胞膜表达ICAM-1增高。抗ICAM-1单抗和TNF共同刺激则粘附的PMN明显减少，说明ICAM-1介导了TNF诱导的内皮细胞与白细胞之间的粘附。N组SNAP500μm刺激内皮细胞表达ICAM-1以及内皮细胞与白细胞粘附同C组比无显著性差异。说明SNAP本身不影响ICAM-1的表达。TN组内皮细胞膜ICAM-1表达以及粘附的白细胞数同T组比明显减少，说明SUAP即NO可降低TNF诱导的内皮细胞ICAM-1的表达，从而降低炎性细胞与内皮细胞粘附。
作者单位：刘宝刚 200080 上海市第一人民医院麻醉科；曾邦雄 同济医科大学附属协和医院麻醉科
