一、什么是分子流行病学
近年来把群体研究与个体研究、宏观研究与微观研究结合起来，研究病原体的表型特征和基因型特征，运用分子生物学技术进行病因的探索，形成了分子流行病学。
常用的病原体分离、形态观察、血清反应、生化反应、组织培养、动物反应类型都是病原体的表型(phenotype)特征。表型特征易受环境因素影响。分子生物学则是分析其基因型(genotype)特征，基因型特征是遗传特征，相当稳定，是鉴定和诊断的重要依据。众多疾病都有各自的分子流行病学，例如癌症有肿瘤的分子流行病学。正在研究中的结核属于传染病之一，传染病的分子流行病学是应用分子生物学技术，研究病原微生物的蛋白质和核酸分子结构上的差异，来阐明感染性疾病的流行病学问题，例如病原体的检测分型、变异和流行过程的追踪，以及传染病的自然史等。换言之，即运用分子生物学DNA指纹技术，与传统的传染病(如结核病)流行病学研究相结合，以确定传染病的起源、传播、分布、消长和流行规律。
二、研究结核病分子流行病学的意义
在细胞水平时代，对结核病流行病学两大问题——传播途径和传染源，是了解得不够确切和很不深刻的，从传染与发病的关系上鉴定外源性再感染，用噬菌体分型毫无实际价值。又如以耐药性测定作为流行病学调查方式之一，作用也极有限。在分子水平时代，应用限制性片段长度多态性(RFLP)分析等指纹技术，则能克服过去的不足。
根据10多年来研究情况，其探索范围概括起来有下列8点：
1.探明暴发流行上的传染关系。当一个地区发生了结核病暴发流行，用DNA指纹法可以确定过去用细胞生物学技术所无法确定的传染源病例［或索引病例（index case）］，因为暴发流行时都是同一病原菌株所传播。这是过去10年多近1/3有关文献的焦点［2］，每次都查出包括约2～20个菌株相同的病例群(或病例簇，cluster)，从而采取对策，尽快扑灭流行。例如Kiers等［3］(1997)在结核病低发流行的荷兰，从1例儿童结核性脑膜炎发病起，快捷采取向心法和离心法追查其接触者，筛查的6 519人中，有276例感染，49例有活动性肺结核，其中28例培养物的DNA指纹都呈同一型图谱(pattern),5个月后在英国查出传染源病例，这是一场荷兰前所未有的国际结核病暴发流行的调查。
2.区别内源性复燃，还是外源性再感染和重感染(reactivation,reinfection,superinfection),以及查出“重传播者”(super-transmitter)。在肯尼亚，有5例结核患者在正规的化疗治愈后2～19月内复发，将保存的原结核分支杆菌分离物和现在的分离物相比较，4例完全相同，表明为内源性复燃，属治疗失败；1例相异，为外源性再感染［4］。
中太平洋法属波利尼西亚为结核病低发区，近20年人口呈地域稳定性，1992年对66例结核患者的分离株作指纹检查，发现除潜伏的结核病复发外，仍有外源性感染。南印度有类似的报告［5］。南非金矿矿工的150份分离物检查，发现相当多的结核病例的指纹图谱相同或相似，表明是由于不断发展的内部传播，其严重程度远大于外来移民的旧病复发。赞比亚是结核与艾滋病都高发的国家，移民较少，指纹调查发现3/4病例的图谱相似，表明患者属于同一个大家族。香港地区进行过类似调查［6］。Rigouts等［7］在短程化疗的几个月期间，对33例作过两次监测，其中有5例是不同菌株，都为敏感菌株，如果是相同的敏感菌株，则表明化疗尚未奏效；不同的敏感菌株，表明可能为另外的再感染，化疗并未起作用。
3.区别新近感染抑或久远感染、混合感染，证实涂阴培阳者的传播及其危害程度。指纹谱带相同，表示直接传播；谱带相似表示近期传播；谱带相似之点很少，表明可能为久远传播；谱带不同表示无传播。1992～1993年美国对阿肯色的居民结核病338例作DNA指纹分析，从238例分离物获得的指纹结果认为该地域内患者群可能不代表新近感染。伦敦西北区3所医院调查发现：非洲裔黑人病例比白种人多3倍，而性别、出生地、过去治疗史都无统计学差异，表明在特定的局部流行社区，结核病以种族间传播为主。在旧金山，对927例检查发现新近传播较多见于在美国出生者，占17%，1994年传播者较1991年有减少，表明干预手段获成效。Shafer查出可同时感染2种不同菌株，我国一篇报告与之类似：同一患者痰和膝关节脓培养物的结核分支杆菌菌株DNA指纹图谱有较大的差异，提示其传染来源不同［1］。
对于涂阴病例的传播，过去有人认为微不足道，但涂阴并非菌阴，包括涂阴培阳，既有培养物则可作DNA指纹分析，一篇结果证明涂阴培阳传播者占17%［8］。
4.识别耐药菌感染流行。Moss等［9］对1992年纽约市26所医院的耐多药结核病患者的分离株作指纹检查，发现一种结核分支杆菌的W菌株，它同时耐4种一线药(异烟肼、利福平、乙胺乙醇、吡嗪酰胺)和卡那霉素，且与AIDS联系密切，82%W菌株患者都是HIV(＋)，如不作指纹分析，则无从识别。另有一相反的实例，Wilson等［10］(1999)在德克萨斯根据指纹图谱调查结果认为基于病例簇的百分率低和簇群狭小，在德克萨斯没有耐药结核病广泛传播的证据。
5.区别院内交叉感染和患者间重染。院内纤支镜等医疗器械所引起的交叉感染、患者间的交叉感染、夫妇间感染、同车间感染、大家庭大家族亲属间互相感染、近亲还是远亲传播，图谱相同的病例簇，结合发病期分析，可以判定谁先谁后。例如在法国一所2 250张床的大医院，对一年中住院结核患者140例作指纹检查后认为成簇的结核病并非院内传播，而是由于社区传播，是在收容所和流动工人住所中传播所致［11］。
6.在菌株和菌种之间进行碱基替代的判断、菌种的鉴定，了解结核分支杆菌毒力与分子的关系，以及监测卡介苗的效果。Zhang等［12］用脉冲场凝胶电泳法(PFGE)观察限制性大片段(LRF)，能鉴定不同BCG菌株的基因差异及特异性亚型，有助于流行病学调查(流调)、监测卡介苗生产和卡介苗的效果。van Soolingen等［13］在BCG广泛应用的中国和突尼斯发现，结核分支杆菌基因型变化比未应用BCG的地区如荷兰和埃塞俄比亚为少，中国的邻国蒙古、韩国和泰国有类似的基因型变化小的情况，提示具有选择性优势的基因型进化，而产生一种假说：BCG的使用可能引起优势克隆的选择。还提出在东亚的结核分支杆菌中，有一种单遗传型占优势的北京家族(Beijing family)，曾在中国、蒙古、韩国和泰国出现，此家族祖先源于中国，绵延近一百年。华裔占泰国人口10%，大多数在20世纪上半叶从中国东南沿海诸省迁往泰国，泰国学者推论东南亚诸国有类似情况［14］，有待证实。
7.实验室质量控制［15］。临床实验室由于污染，常发生假阳性，聚合酶链反应(PCR)查痰菌假阳性率较高，BACTEC有少数假阳性，痰菌培养也有个别假阳性。临床提出疑问后，实验室应再作指纹分析，如果RFLP IS6110不出现图谱表明前次PCR为假阳性，有混合图谱者为有污染。
8.建立结核分支杆菌基因资料库。通过对不同区域的分离株进行DNA指纹分析，将会对全球、全国、全省、全地区范围的结核分支杆菌的相关性及传播关系进一步了解，从而针对性地制定控制政策，并建立基因资料库，例如澳大利亚、加拿大、美国、荷兰等已逐步建立了结核分支杆菌基因资料库，纳入结核病控制的整体规划中。
三、DNA指纹的基本方法——标准RFLP分析法
Embden等［16］(1993)推荐了标准的结核分支杆菌RFLP分析方法学，已在国际上得到广泛认同并采用。使全球范围内结核分支杆菌菌株水平鉴定的比较成为可能。
1.步骤：(1) 提取结核分支杆菌染色体DNA：破壁、处理、离心收集DNA。(2) 限制性内切酶酶解DNA：内切酶能在DNA特殊序列位点切割寡核苷酸片段，产生多种可测量的片段。最常用的内切酶是PvuⅡ，其次是Bst EⅡ、BcⅡ、HaeⅢ、PstⅠ、Bam HI等，约10多种供选择。(3) 凝胶电泳分离DNA片段：不同长度的DNA片段在凝胶中得到分离，DNA的微小突变都可引起菌株间DNA切断位点不同，使寡核苷酸片段长度出现差异。(4) Southern印迹杂交：将凝胶上的DNA片段转移到固相滤膜与DNA探针杂交，探针与DNA谱带的重复片段结合，即可使靶DNA片段显影。显影法有放射自显影、溴乙锭染色荧光目测等，亲缘菌株将产生相似或相同的谱带特征。
目前多采用非同位素标记的地高辛作探针IS6110的标志物。关于PCR和任意引物PCR技术，由于快速、简便等优点，也被广泛应用。
2.其它DNA指纹技术：(1)PCR限制性酶图谱分析(PRA)，用于鉴别非结核分支杆菌。(2) 快速DNA指纹及混合连锁PCR，用以鉴别实验室交叉污染及误判，获取分离物后2 d内可出结果。(3) 随机扩增多态性DNA分析(RAPD)，用编码16S～23S rRNA基因分隔区进行PCR扩增，其鉴别力高于用整个
