Nature子刊:利用CRISPR/Cas9清除人T细胞基因组中的HIV-1

生物谷   2016/03/23

2016年3月23日/生物谷BIOON/--人免疫缺陷病毒(HIV)导致获得性免疫缺陷综合征(AIDS),即艾滋病。在一项新的研究中,来自美国天普大学路易斯-卡茨医学院(Lewis Katz School of Medicine at Temple University)的研究人员开发出一种特定的基因编辑系统CRISPR/Cas9,从而为最终治愈HIV感染铺平道路。他们证实利用这种基因编辑系统能够有效地和安全地将这种病毒从在体外培养的人T细胞的DNA中清理掉。相关研究结果于2016年3月4日在线发表在自然出版集团旗下的Scientific Reports期刊上,论文标题为“Elimination of HIV-1 Genomes from Human T-lymphoid Cells by CRISPR/Cas9 Gene Editing”。

论文共同通信作者、天普大学路易斯-卡茨医学院综合NeuroAIDS中心主任、神经病毒学中心主任、神经科学系主任和教授Kamel Khalili博士说,“抗逆转录病毒药物非常善于控制HIV感染。但是接受抗逆转病毒药物治疗的病人一旦停止服用药物,就会遭遇到HIV复制快速反弹。”大量HIV拷贝的存在削弱免疫系统,最终导致AIDS。

治愈HIV/AIDS---自从上个世纪八十年代首次发现HIV以来,它已夺去了2500万多人的生命---是HIV研究的最终目标。但是一旦它整合进CD4+ T细胞---HIV感染的主要细胞---的基因组后,清除这种病毒已被证明非常困难。近期的努力有意专注于重新激活HIV以便触发强劲的免疫反应从而能够从被感染的细胞中根除这种病毒。然而,在此之前,这些“激活并杀死(shock and kill)”方法中没有一种获得成功。

Khalili博士和同事们决定尝试着一种不同的方法:利用一种独特的定制基因编辑系统CRISPR/Cas9特异性地靶向HIV-1前病毒DNA(整合到宿主细胞DNA中的病毒基因组)。他们的系统包括一种特异性地靶向T细胞基因组中HIV-1 DNA的向导RNA(gRNA),和一种切割T细胞DNA链的核酸酶Cas9。一旦Cas9在基因编辑过程中删除HIV-1 DNA序列,那么T细胞基因组的松散末端被该细胞自身的DNA修复机制重新连接在一起。

在之前的研究中,Khalili博士的研究团队已证实他们的基因编辑系统CRISPR/Cas9能够从人细胞系中切除HIV-1 DNA。然而,在这项新的研究中,他们着重研究HIV潜伏地和有效地感染的人CD4+ T细胞,并证实这种技术不仅将这种病毒从T细胞中清除,而且在HIV-1已被根除的T细胞中,这种系统的持续存在阻止它们再次感染。更为重要的是,他们在体外开展实验,先将来自HIV感染者的T细胞在体外进行培养,随后证实利用这种基因编辑系统处理这些T细胞能够抑制病毒复制和显著地降低病人T细胞中的病毒载量。

在这项研究的另一个重要组成部分中,Khalili博士的研究团队解决了关于脱靶效应和毒性的问题。利用一种被称作超深全基因组测序的方法,它也被认为是评估基因组的金标准,研究人员分析了HIV-1已被根除的T细胞的基因组,以便确定gRNA靶向的基因组区域以外的基因是否发生突变。他们的分析结果排除了基因发生脱靶效应,包括对T细胞基因表达的间接影响。对T细胞活力和增殖的研究证实HIV-1已被根除的T细胞正常地生长和发挥功能。

Khalili博士说,“这些发现的重要性体现在多个层次上。它们证实我们的基因编辑系统能够将HIV从CD4+ T细胞DNA中有效地清除掉,而且通过让HIV-1基因组发生突变,从而永久性地让它不能复制。再者,它们证实这种系统能够让T细胞免受再次感染,而且这种技术对T细胞是安全的,没有毒性作用。”

他补充道,“在此之前,人们从未在这种程度上开展这些实验。但是[我们开展的这些实验]解决的问题是比较关键的,而且这些结果允许我们利用这种技术继续取得进展。”(生物谷 Bioon.com)

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Elimination of HIV-1 Genomes from Human T-lymphoid Cells by CRISPR/Cas9 Gene Editing

doi:10.1038/srep22555

Rafal Kaminski, Yilan Chen, Tracy Fischer, Ellen Tedaldi, Alessandro Napoli, Yonggang Zhang, Jonathan Karn, Wenhui Hu & Kamel Khalili

We employed an RNA-guided CRISPR/Cas9 DNA editing system to precisely remove the entire HIV-1 genome spanning between 5′ and 3′ LTRs of integrated HIV-1 proviral DNA copies from latently infected human CD4+ T-cells. Comprehensive assessment of whole-genome sequencing of HIV-1 eradicated cells ruled out any off-target effects by our CRISPR/Cas9 technology that might compromise the integrity of the host genome and further showed no effect on several cell health indices including viability, cell cycle and apoptosis. Persistent co-expression of Cas9 and the specific targeting guide RNAs in HIV-1-eradicated T-cells protected them against new infection by HIV-1. Lentivirus-delivered CRISPR/Cas9 significantly diminished HIV-1 replication in infected primary CD4+ T-cell cultures and drastically reduced viral load in ex vivo culture of CD4+ T-cells obtained from HIV-1 infected patients. Thus, gene editing using CRISPR/Cas9 may provide a new therapeutic path for eliminating HIV-1 DNA from CD4+ T-cells and potentially serve as a novel and effective platform toward curing AIDS.

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